共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合HA和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性HA蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的HA蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-HA和rDHN3mF-2HA。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(HA)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后HA基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的HA蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2HA较rDHN3mF-HA更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感HA蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

一株H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因的克隆及分子特征

采用RT-PCR方法对H9N2亚型禽流感病毒Ck/GS/2/99株非结构蛋白NS基因进行了扩增,将其克隆到pGEM-T easy载体后进行序列测定与分析。结果表明,该株病毒NS基因开放阅读框(ORF)由890个碱基组成,编码272个氨基酸。经同源性与系统发生树分析表明,该毒株NS基因都与Ck/NX/4/99株的核苷酸和氨基酸同源性在99%以上,与Ck/HB/31/00、Ck/SD/6/96和Sw/HK/10/98关系密切。

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因的克隆及原核表达

目的:为防控禽流感在家禽和水禽中的流行,从而控制对人的感染,探讨一种能区别自然感染鸡和疫苗免疫鸡的鉴别诊断方法。方法:采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的NS1基因(660bp);并将该片段克隆至pET-28(a)质粒中,构建重组表达载体pET-NS1,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,以终浓度0.7mmol/L的IPTG诱导表达6h,并应用Western-blot方法分析表达产物的反应原性。结果:pET-NS1载体能高效表达NS1蛋白,相对分子质量约25000,纯化产物能与该亚型的AIV活病毒感染鸡血清发生特异性反应而与灭活病毒免疫鸡血清不发生反应。结论:NS1基因在大肠埃希氏菌中的表达产物可用来鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群。

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的：对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1（NS1）基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法：从GenBank获得2006-2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果：经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%-100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%-90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论：为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。

H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1(nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响。方法 :从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达。MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用。结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础。

H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白S145N变异株致病性及抗原特性

为确定近年来H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白S145N点突变对病毒毒力变化和抗原性变异的影响,笔者对从全国不同地区分离的12株H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株和HP疫苗参考株进行了半数鸡胚感染量(EID50)、半数鸡胚致死量(ELD50)、平均鸡胚致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指数(ICPI)、鸡静脉致病指数(IVPI)和8周龄SPF鸡感染排毒试验,并与抗H9N2亚型AIV HP参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性进行测定。结果发现,H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株毒力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。单抗2A4和F6不能抑制H9N2亚型AIV HA蛋白S145N变异株的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。研究结果表明,H9N2亚型AIV呈现变异趋势,有毒力增强和抗原性变异毒株出现。S145为H9N2亚型AIV HA蛋白的1个抗原位点,是血凝抑制抗体结合的位点,但有该位点漂变导致抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用。这提示该病的防控面临着新的挑战。

H_3N_2亚型人流行性感冒病毒HA_1的蛋白序列同源性比较、变异规律及结构与功能的分析

应用生物信息学数据库和工具,结合自身的实验结果,对现有的H3N2亚型人流行性感冒(流感)病毒全球分离株的HA1氨基酸序列和蛋白分子结构进行了分析研究。初步的进化分析结果表明,历史上的分离株大致分为以年代划分为特征的两大谱系,即1968～1984/1985年的谱系,时间跨度为18年;1984/1985～1997/2000年的谱系,时间跨度为13～17年。它们分别起源于两类毒株,并在各自的谱系内发展演化,基本上不存在大规模相互交叉渗透的现象。在1984/1985年,两大谱系发生交替转换和过渡,说明流感病毒的起源、发展和演化是有一定规律性的,这可能对流感的监测预报有一定的指导意义。绝大多数毒株的二硫键组成位点和糖基化位点是极其保守的。受体结合位点(RBS)的一部分构成成份保守;其他构成成份发生变异甚至高变,并与某些抗原决定簇位点重合,可能参与了抗原抗体相互作用。5个抗原决定簇位点的变异各有其特点。A和B位点的变异表现最活跃,抗原性最强,但B位点稍弱于A位点。C和D位点的抗原性一般,且D位点的变异性低于C位点。E位点抗原性一般。在各位置的变异中,大多常是相同相近性质或相同种类的氨基酸相互替换。HA1蛋白全序列的熵(entropy)峰值作图的分析表明,HA1蛋白上121～126位等区域或位点可能独立,或参与构成了某些已知或未知?

金丝桃素蛋白络合物在鸡体内对H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果的研究

为了明确金丝桃素蛋白络合物在动物体内对H9N2亚型AIV的杀灭效果及临床上用于预防和治疗的剂量,将180只28日龄非免疫石歧杂黄鸡随机分为6组,分别为金丝桃素蛋白络合物高、中、低剂量组,金刚烷胺药物对照组,感染不给药组及健康对照组。其中,金丝桃素蛋白络合物三个剂量组的实验鸡于感染H9N2亚型AIV12h后分别以不同的剂量灌服给药,而金刚烷胺药物组于攻毒12h后以100mg/l饮水。用棉拭子采集各实验组鸡的咽喉及泄殖腔黏液,进行微量血凝(HA)试验及RT-PCR检测,以确定各实验组鸡的排毒情况。结果表明,金丝桃素蛋白络合物对人工感染H9N2亚型AIV的实验鸡有较好的保护作用,与金刚烷胺药物对照及感染不给药组相比有显著差异。

我国鸡源H9N2亚型禽流感病毒NS基因的分子进化分析

目的为了明确国内鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白(NS)基因系统进化情况,对1998-2008年间分离自发病鸡群中的14株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了非结构蛋白(NS)基因的克隆和序列测定,得到了NS1和NS2蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列作比对,结果14株AIV的NS基因同源性在92.9%～99.9%,在系统进化上均属于NS基因A等位基因群中的A/Chicken/Beijing/1/1994分支。综合已有的研究结果,表明尽管A/Quail/Hongkong/G1/1997分支和A/Duck/Hongkong/Y439/1997分支的NS基因曾偶尔传入鸡群,但并未在我国鸡群中建立稳定的亚系。国内的H9亚型AIV的NS基因仅稳定存在着A/Chicken/Beijing/1/1994分支。

H9N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其序列特征

用RT PCR技术扩增到H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shanghai/F/ 98(简称F株 )的核蛋白 (NP)全基因。 18个毒株NP基因核苷酸序列比较结果显示 ,以Q/HK/G1/ 97为代表的、并和同期香港发生的人流感事件有直接联系的毒株相互间同源率达 98.3%～ 99.3% ,而F株与它们的同源率为 92 .2 %～ 92 .8%。遗传进化分析结果表明 ,F株独成一组 ,可暂时划分到类C/Ko/ 32 3/ 96亚系。

H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。

不同来源H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白生物学分析

目的 对不同来源的H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白进行生物信息学比较分析,以找出重要的生物信息学数据。方法 从Genebank的基因数据库中获取18株H9N2亚型禽流感病毒H9血凝素蛋白的核苷酸和氨基酸序列,运用Clustal X,Bioedit等国际通用软件进行氨基酸和核苷酸的序列比对,计算核苷酸及氨基酸的同源性。在线软件Antheprot分析二级结构。结果 H9型血凝素蛋白编码框架长约1683bp,编码含560个氨基酸的多肽。18株H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因同源率为90.6%~99.8%,血凝素蛋白的氨基酸同源率为93.0%~99.4%,多肽序列中有84个变异位点,变异率为15.03%。血凝素蛋白A1和A2裂解序列为位于aa333-aa341的PSRSSR↓GLF序列;其中1株出现A334T变异,另一株则出现R335G变异。H9血凝素蛋白富含潜在α螺旋（25%~27%）,β折叠（29%~32%）,β转角（25%~27%）及无规则卷曲（17%~19%）等结构;H9型血凝素蛋白受体结合位点是由R100、W161、T163、N191、198（A/V/T）、L202、Y203位氨基酸残基折叠构成。结论 H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白重要功能结构域的序列和空间结构相对保守稳定。

蝙蝠流感病毒与H9N2亚型禽流感病毒M蛋白的免疫原性比较研究

为比较新发蝙蝠流感病毒H17N10亚型与禽流感病毒H9N2亚型的M蛋白(包括M1和M2蛋白)的免疫原性,分别构建两种亚型流感病毒M1、M2的原核表达载体和真核表达载体,利用前期反向遗传学技术拯救获得两种重组病毒感染MDCK细胞,并分别与相应的单抗或多抗进行免疫印迹和免疫荧光鉴定。结果显示,两种亚型病毒的M1蛋白的原核表达产物均与M1多抗反应,均不与2株M1单抗反应;拯救的两种重组病毒感染细胞后及其M1蛋白的真核表达产物均与M1的单抗5F2反应,不与单抗3G8及M1的多抗反应,两种亚型的结果一致;而两种亚型的M2蛋白通过与单抗和多抗反应,出现了不一致的结果,M2的单抗仅与蝙蝠流感病毒M2的原核表达产物反应,不与H9N2禽流感病毒M2的原核表达产物反应,M2的多抗则反之;且M2的多抗仅与H9N2禽流感M2的真核表达产物以及拯救病毒反应,均不与蝙蝠流感病毒M2的真核表达产物及拯救病毒反应。本研究证实这两种亚型流感病毒的M2蛋白之间确实存在免疫原性的差异,并且筛选到了可以区分蝙蝠流感病毒和禽流感病毒的M2抗体,为进一步研究流感病毒M蛋白相关的生物学机制提供了基础。

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚。选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点;利用单抗对2017—2019年H9N2亚型AIV代表株进行HI抗原谱分析,确定抗原位点与基因分型关系;分析我国H9N2亚型AIV相应抗原位点的变异规律。结果显示:单抗2E4与2D6分别识别HA头部的145位和153位抗原位点;2017—2019年华东地区H9N2亚型AIV分离株根据HA基因遗传进化树可分为Group 1和Group 2两大分支,Group 1代表株与两株单抗反应性好,而Group 2代表株与两株单抗反应性差,序列分析发现已发生S145D(16/16)和D153G(15/16)的突变;通过对我国1996—2021年禽源H9N2亚型AIV HA蛋白位点自然突变率分析发现,含HA蛋白145D和153G的毒株占比分别上升至68%和66%,成为优势流行株。单抗2E4可用于当前H9N2亚型AIV的抗原分型,抗原位点145位是鉴别Group 1和Group 2抗原群差异的分子靶标之一。

H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。

不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制(HI)和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变(S→N),导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点(S145)为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。

我国部分鸡源H9N2亚型流感病毒NS1基因序列分析

对 1 996年至 2 0 0 1年间自我国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的 8株H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白基因 (NS1 )进行了扩增和序列测定 ,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明 ,NS1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为 96 5 %～ 99 5 %和94 5～ 98 6% ,说明NS1基因在遗传进化上高度保守 ,稳定遗传。与中国香港、韩国、巴基斯坦及人源H9N2分离株相比较 ,发现中国大陆的鸡源H9N2分离株的NS1基因在其羧基端缺少 1 3个氨基酸。系统进化树分析表明 ,该 8株病毒的NS1基因属于相同的进化分支 ,而且中国的早年分离株A chicken Beijing 1 94位于该进化分支的根部 ,暗示这些分离株的NS1基因是由A chicken Beijing 1 94演化而来 ;尚未发现NS1基因属于A quail HongKong G1 97 like分支的分离株。同时 ,系统进化树也说明了我国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化分支 。

波形蛋白对H9N2亚型AIV复制的影响研究

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋白表达显著被抑制。荧光定量PCR结果亦证实病毒HA基因在AIV感染后36 h时表达水平明显降低。上述结果表明,H9N2亚型AIV在人源Hela细胞上的早期复制中,vimentin能起到一定程度上的抑制作用,且其重组表达蛋白孵育细胞能够阻断H9N2亚型AIV对细胞的感染,为深入研究vimentin抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗H9N2亚型AIV的药物研发提供了参考。

两株不同年代H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白免疫原性研究

为探究两株不同年代H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的免疫原性,试验采用RT-PCR方法分别扩增出A/Chicken/Henan/01/2006(HN106株)和A/Chicken/Henan/13/2010(X-13株)的HA基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,获得重组表达质粒pET-06-HA和pET-13-HA。将鉴定正确的阳性菌株用IPTG诱导表达后,对表达产物进行纯化和Western-blot分析。将纯化的pET-06-HA和pET-13-HA重组蛋白分别制备成亚单位疫苗免疫SPF鸡,用血凝抑制(HI)和间接ELISA试验分别检测免疫后0,7,14,21天06-HA蛋白免疫组、13-HA蛋白免疫组、对照组的血清抗体水平。结果表明:诱导表达出的重组蛋白pET-06-HA分子质量为80.3 ku,以包涵体的形式存在;重组蛋白pET-13-HA分子质量为80.8 ku,以可溶的形式存在。重组蛋白均能与相应的阳性血清发生特异性免疫反应,而不发生交叉反应。以HN106株和X-13株为4单位抗原分别检测血清抗体效价,各免疫组免疫7,14,21 d后与对照组相比平均抗体效价显著上升(P<0.01)。两种重组蛋白均能引起免疫鸡只较高的体液免疫水平;以06-HA蛋白为包被抗原测定06-HA蛋白免疫组和13-HA蛋白免疫组免疫14,21 d后血清抗体,两组之间抗体水平差异显著(P<0.01)。说明两株不同年代H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白免疫原性良好且抗原性具有一定差异,可用于H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白功能研究以及亚单位疫苗的研制。