H9N2 AIV灭活疫苗免疫SPF鸡攻毒后肺组织免疫相关基因表达变化研究

[目的]本试验旨在探究H9N2亚型禽流感病毒攻击对H9灭活疫苗免疫SPF鸡呼吸系统的影响。[方法]选用36只3周龄SPF鸡,随机分为对照组(Con)、攻毒组(Flu)、免疫后攻毒组(Vac+Flu)。以每只0.4 mL剂量免疫接种H9灭活疫苗,3周后以10~6 EID_(50)的病毒量进行攻毒,采集拭子、血清、气管、肺组织等样品,通过血凝抑制(HI)试验、RT-PCR、荧光定量PCR(qPCR)等方法检测血清中HI抗体滴度、肺脏流感病毒M基因拷贝数以及免疫相关基因CD4、CD8、GATA3、T-bet、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme、FasL、Fas等的表达量;并利用HE染色、免疫组织化学的方法观察气管、肺脏的病理变化及病毒特异性抗原NP蛋白的分布特征。[结果]HI试验结果显示,SPF鸡疫苗免疫后可产生较高的H9N2 AIV抗体效价。免疫保护试验和RT-PCR结果显示,SPF鸡疫苗免疫后攻毒仍能检测到机体排毒和流感病毒M基因在肺脏组织中的表达。HE染色和免疫组化结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够明显减轻SPF鸡气管和肺脏的病理损伤,降低气管、肺脏中的病毒载量。荧光定量PCR结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后能够提高SPF鸡肺脏中Th1、Th2细胞因子分泌水平,促进穿孔素/颗粒酶途径相关基因表达进而增强肺脏中细胞毒性反应。[结论]H9N2疫苗免疫鸡感染H9病毒后虽然仍存在排毒现象,但其抗病毒免疫系统活跃、其主要器官病毒载量降低,建议按照流感疫苗免疫程序进行免疫接种,提高对流感的防控水平。

铁基纳米酶增强H9N2禽流感病毒灭活疫苗的黏膜免疫效果评价

H9N2禽流感病毒主要通过禽类的呼吸道和消化道向外排毒,对我国养禽业造成了极大的威胁。该研究探究了铁基纳米酶对接种H9N2灭活疫苗小鼠局部黏膜和全身系统性免疫应答水平的影响。该研究首先通过水热合成法合成壳聚糖修饰铁基纳米酶(CS-IONzyme)及铁基纳米酶(IONzyme),然后将CS-IONzyme和IONzyme与灭活H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 WIV)在室温下搅拌连接后,滴鼻免疫小鼠,第0 d和14 d免疫。首免后28 d,收集小鼠血清和鼻腔、气管、肺脏涮洗液,采用间接ELISA方法检测H9N2亚型禽流感病毒特异性抗体水平、HI试验检测HI抗体水平。结果显示,与单独H9N2 WIV组相比,“IONzyme+H9N2WIV”和“CS-IONzyme+H9N2 WIV”组小鼠的鼻腔、气管、肺脏涮洗液中H9N2禽流感病毒特异性IgA抗体水平显著上调,血清抗体水平(IgG、IgG1和IgG2a/c)及HI抗体水平显著上调。与其他组相比,“CSIONzyme+H9N2 WIV”组小鼠的抗体水平更高。这表明,IONzyme和CS-IONzyme可以作为鼻腔黏膜佐剂,配合H9N2禽流感病毒灭活疫苗,可以显著提高小鼠局部黏膜和全身系统性免疫应答水平,为H9N2禽流感病毒的防控提供指导。

左旋咪唑影响流感灭活疫苗(H9N2)抗体滴度

为了研究不同剂量的左旋咪唑对鸡流感病疫苗免疫效果的影响,将20只17日龄雏鸡,随机分成A、B、C、D四组,每组5只。分别皮下注射H9N2灭活疫苗0.5ml/羽,同时给试验组A(0.6mg)、B(0.3mg)、C(0.15mg)剂量的左旋咪唑,D组注射生理盐水作为对照。免疫后0、7、14、21和28天,翅下静脉采血检测抗H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度。结果表明,给药组的抗体水平都明显高于对照组;不同给药剂量的组别的抗体水平也存在差别,0.6mg、0.3mg剂量组鸡只平均抗体水平基本一致,却明显低于0.15mg的低剂量组。这表明左旋咪唑影响H9N2流感病毒疫苗抗体滴度,低剂量(0.15mg)添加左旋咪唑,可提高疫苗的抗体水平。

H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选

为筛选出具有良好免疫原性的禽流感病毒(AIV)H9N2亚型灭活流行株种毒,选择2008年中国大陆8个省份15株H9N2亚型AIV分离株进行抗原性分析,选取代表流行株进行鉴定并制备灭活疫苗,进行免疫效力评估。实验结果显示,2008年分离株之间抗原性比较接近,与2000年前分离株的抗原性相差较大;2008年分离的8株病毒HA基因核苷酸同源率在93.2%～98.6%之间,而CK/SH/10/01毒株与这8株病毒的同源率仅在91.9%～93.5%之间;CK/ZJ/17/08、CK/SD/2CZ/08、DK/FJ/560/08、CK/FJ/521/08、CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08候选株病毒在SPF鸡胚上连续传15代HA价及致病性等均未改变,SPF鸡鼻腔感染106EID50各毒株后均无任何症状和死亡出现;候选株灭活疫苗免疫SPF鸡3周时,产生针对疫苗株抗原检测的HI抗体介于10.35log2～11.811log2,以106EID50剂量鼻腔感染途径攻毒后,只有CK/HuN/174/08和CK/HuN/33/08株灭活疫苗免疫鸡不仅可以对同源毒株的攻击提供良好的免疫保护,而且对2008年分离的异源毒株的攻击也能提供比较理想的免疫保护,可作为适合我国大部分地区应用的H9N2亚型禽流感灭活疫苗种毒株。

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果评价

为充分了解10多年来在生产中普遍使用的H9N2亚型禽流感(AI)灭活疫苗(F株)对鸡群的免疫保护效果,本研究以F株灭活疫苗分别接种SPF鸡和罗曼鸡,通过检测其抗体水平,分析比较抗体消长规律;同时以2009～2010年间从免疫鸡群中分离到的9株H9N2亚型AIV为素材,通过F株灭活苗免疫攻击试验,来评价该疫苗对上述9株分离株体内感染的免疫保护效果。结果显示:F株灭活疫苗免疫SPF鸡和罗曼鸡3周后,产生的HI抗体效价均在7log2以上,且持续时间长,SPF鸡达15周,罗曼鸡在11周以上。SPF鸡免疫群用F9株、L9株、S9株和D9株和F株攻击7d后,对鸡的咽喉和泄殖腔排毒有100%的抑制作用,用其它5株(F119、W9、YD、M和D119)攻击后的抑制作用为90%;罗曼鸡免疫群用L9株、F9株、S9株、D9株、W9株和F株攻击7d后,对鸡咽喉和泄殖腔排毒有100%的抑制作用,用其它4株(F119株、YD株、M株和D119株)攻击后的抑制作用为90%;未接种疫苗的对照组鸡攻击7d后排毒率均为10/10。

囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响

为研究囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响,将200只鸡分为疫苗组、疫苗+囊素组、囊素组和对照组,每组50只。从13日龄起每7 d测定其法氏囊指数、禽流感(H9)HI抗体水平。结果表明:囊素肽能提高禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫后的抗体水平,并延长高水平抗体的维持期,能显著地促进法氏囊的生长发育。

H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化分析及F株灭活疫苗的免疫效果评价

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)变异情况及评价作为H9亚型F株禽流感灭活疫苗的免疫效果,本研究对2009年～2010年期间从免疫鸡群中分离的9个H9N2亚型AIV株进行血凝素(HA)基因序列测定和分析。这9个病毒株HA基因编码区长度均为1 683 nt,HA基因核苷酸序列同源性为90.7%～98.9%,其推导氨基酸序列同源性为92.2%～98.8%;分离株与F株的HA基因之间的核苷酸序列同源性为91.6%～99.6%,氨基酸序列同源性为92.9%～99.3%;9个分离株与F株均属于Beijing/1/94-like进化分支,但分别属于3个不同的基因亚型。免疫试验结果显示:3周龄SPF鸡接种F株灭活疫苗21 d后,产生的HI抗体效价在log2 9以上;而且免疫鸡对分离株及F株攻毒后的喉头和泄殖腔排毒产生明显的抑制作用。本研究数据表明,F株灭活疫苗可以提供对这些分离株的有效免疫保护。

鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(H9N2)三联灭活疫苗的安全性研究

为证实鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(新支流)三联灭活油乳疫苗的安全性,通过颈部皮下注射接种14日龄来航鸡,每日测定鸡的体重,连续监测28 d,用t检验分析对照组和免疫组体重之间的差异显著性。试验结果表明,免疫接种组和空白对照组体重差异不显著,所制备的新支流三联疫苗不影响鸡的生长性能,对鸡安全。

H9N2亚型禽流感病毒流行特征及疫苗研究进展

H9N2是一种对全球家禽业造成重要影响的低致病性禽流感病毒,1994年至今,其作为一种人畜共患病原体在我国持续流行变异,对家禽产业和人类生命健康构成严重危害。尤其是H9N2病毒与其他流感病毒间发生的基因重排或重组事件,使禽流感病毒可能跨越物种屏障感染人类和其他哺乳动物,给全球公共卫生带来新的威胁。因此,本文对H9N2的流行特征及其疫苗研发进展进行综述,希望对保护禽类产业经济健康和全球公共卫生安全提供参考。

两种佐剂在H9N2亚型禽流感灭活疫苗中的效果比较

为提高H9N2亚型禽流感灭活疫苗的免疫效力,拟从Carbigen和Marcol-52两种佐剂中选择一种适合的疫苗佐剂。利用两种佐剂分别制备H9N2亚型禽流感灭活疫苗,通过SPF鸡免疫后7、14、21、24 d的抗体水平、黏膜系统SIgA含量及攻毒保护率三个方面,对Carbigen和Marcol-52佐剂进行探讨。结果显示,Carbigen佐剂和Marcol-52佐剂疫苗均可以刺激机体产生呼吸道黏膜SIgA和血清抗体。在免疫后第7天至第21天,Carbigen佐剂疫苗组血清抗体水平均高于Marcol-52佐剂疫苗组;Carbigen佐剂疫苗组SIgA产生早于Marcol-52,在第14天Carbigen佐剂疫苗组SIgA含量明显高于Marcol-52佐剂疫苗组(P<0.05),产生SIgA主要部位位于气管叉和肺脏;Carbigen佐剂疫苗组攻毒后的保护率高于Marcol-52佐剂疫苗组。Carbigen佐剂配置的疫苗可刺激接种动物快速产生免疫应答反应,其效果优于Marcol-52佐剂,有望成为H9N2灭活疫苗的候选佐剂。

H9N2亚型禽流感病毒细胞灭活疫苗的免疫效果评价

由于经济和技术因素的制约,尚未有成功的禽流感细胞疫苗产品上市。为此,本研究在细胞扩增而来的含有H9亚型禽流感病毒(AIV)HA和NA基因的SH441HANAPR8(NS mutant)重组病毒里加入终浓度为0.1%的甲醛进行灭活。结果显示,37℃条件下灭活24h的效果最佳。灭活好的H9AIV SH441HANAPR8(NS mutant)与佐剂MontanideISA70VG乳化制备成灭活苗,以0.05、0.1、0.2、0.3mL/只的剂量,分别胸部肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡,并于免疫后21d静脉感染A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)AIV。结果显示,该疫苗的最小免疫剂量为0.2mL。此外,研究还发现,当HI抗体效价≥25时,疫苗对鸡只的攻毒保护率达到100%。

鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗免疫效果研究

为探讨制备的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感(H9亚型)-鸡滑液囊支原体四联灭活疫苗(以下简称新支流滑四联灭活疫苗)免疫效果,试验采用新城疫病毒(NDV)La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞,用易感鸡胚增殖传染性支气管炎病毒(IBV)M41株,H9亚型禽流感病毒(AIV)ML01株接种MDCK-sc悬浮细胞,用改良Frey氏培养基发酵培养鸡滑液囊支原体(MS)ML-MS1株,收获抗原液,制备新支流滑四联灭活疫苗,并对疫苗进行安全性和效力测定;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21 d采血测定NDV HI和AIV(H9亚型)HI抗体,并于免疫后21 d进行NDV和AIV攻毒;30日龄SPF鸡首免H120株,免疫后21 d采血测定IBV HI抗体效价,并以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量进行二免,免疫后7、14、21、28 d采血测定IBV HI抗体;以0.05、0.1、0.3 mL/只的剂量接种30日龄SPF鸡,免疫后7、14、21、30 d采血测定MS ELISA抗体,并于免疫后30 d进行MS攻毒。结果显示:制备的新支流滑四联灭活疫苗安全性良好、效力合格;免疫后21 d NDV HI效价为6.6~8.8 log2,AIV HI效价为7.0~9.7 log2;免疫后28 d IBV HI效价为5.6~7.8 log2,且二免是首免的3.2~14.9倍;免疫后30 d MS ELISA效价为3 164~6 847;攻毒试验结果显示,0.05 mL/只剂量组对ML-MS1攻毒保护率为80%(8/10),其余组均为100%(10/10)保护。研究表明,新支流滑四联灭活疫苗对SPF鸡安全、有效,以0.1 mL/只剂量免疫SPF鸡可获得较好的免疫效果。

猪流感二价灭活疫苗对H1N1亚型流行毒株的攻毒保护效果

旨在评价猪流感二价灭活疫苗(H1N1 LN株+H3N2 HLJ株)对2021年国内H1N1亚型猪流感流行毒株的交叉保护效果。将10头4周龄健康易感猪随机均分为疫苗接种组和对照组,疫苗接种组每头接种疫苗2 mL,首免14 d后进行二免,对照组未接种疫苗;首免后28 d,每头猪经气管内注射A/Swine/Jiangsu/NL33/2021(H1N1)(简称NL33株)4.0 mL;综合临床症状、鼻拭子病毒分离和肺脏病变3个方面进行判定。结果:试验组保护率为80%,对照组发病率为100%。综上,猪流感二价灭活疫苗(H1N1 LN株+H3N2 HLJ株)接种对2021年国内流行的H1N1亚型猪流感病毒攻击产生了较好的交叉保护效果,猪群接种该疫苗后能有效抵抗猪流感流行毒株的攻击。

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因缺失减毒活疫苗候选株对蛋鸡的免疫效力评价

为评价H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因缺失减毒活疫苗候选株r TX-NS1-128对蛋鸡的免疫效力,本研究对蛋鸡H9N2亚型AIV母源抗体半衰期、疫苗适宜免疫时间、抗体免疫保护临界值以及免疫鸡抗体消长规律等进行研究。结果显示,雏鸡H9亚型AIV母源血凝抑制(HI)抗体半衰期为3.29 d。雏鸡母源抗体水平对疫苗的免疫效果有较大的影响,以母源HI抗体滴度约为4 log2时免疫为宜。少数HI抗体滴度为4 log2~6 log2的免疫鸡攻毒后可在5 d或3 d内从咽喉短暂排毒,HI抗体滴度为4 log2、5 log2、6 log2和≥7 log2时攻毒保护率分别为80%、90%、90%和100%,建议该疫苗的抗体免疫保护临界值为5 log2。鸡一次免疫后平均HI抗体滴度在5 log2以上可持续9周左右。本研究为H9N2亚型禽流感新型减毒活疫苗的开发和应用提供依据。

重组禽流感病毒二价灭活疫苗对H5N1亚型7.2分支病毒的攻毒保护性研究

为有效防控2006年以来出现的H5亚型7.2分支禽流感病毒(AIV)引起的免疫鸡群高致病性禽流感(HPAI)的流行,我们构建了重组AIV Re-4疫苗株,研制出含有重组AIV Re-4株的H5亚型二价系列灭活疫苗,并在我国北方地区使用,有效地控制了其流行。2012年我国北方地区再次出现7.2分支病毒引起的HPAI疫情。为评估现有H5亚型二价系列灭活疫苗对该分支病毒的免疫保护效力,本研究首先通过SPF鸡进行免疫攻毒试验评估。结果表明,分别以每羽份(0.3 mL/只)的Re-5+Re-4株和Re-6+Re-4株重组AIV H5二价油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡,免疫3周后针对重组AIV Re-4株的HI抗体均达到8 log2以上;经鼻腔接种7.2分支AIV CK/NX/2/12株(100 LD50)攻毒后,免疫鸡均获得完全保护,即无任何临床症状和排毒现象,而对照组SPF鸡全部发病死亡。此外,以哈尔滨当地养殖场中免疫H5亚型AIV灭活疫苗的48只商品蛋鸡进行攻毒试验,结果显示,商品蛋鸡血清中针对重组AIV Re-4株HI抗体平均滴度为8.3 log2,采用相同方式攻毒后也获得完全保护。本研究结果表明,Re-5+Re-4株和Re-6+Re-4株重组AIV H5二价灭活疫苗均能够对H5亚型7.2分支病毒的攻击提供良好的免疫保护效果。

H3N2亚型犬流感灭活疫苗的免疫效果评价

为研制H3N2亚型犬流感病毒灭活疫苗,本实验通过鸡胚传代的方法培育出一株高繁殖能力的鸡胚适应株CGD1株。分别应用白油和氢氧化铝胶佐剂制备两种灭活疫苗,通过监测疫苗免疫后BALB/c小鼠和比格犬的抗体水平以及比格犬的攻毒保护试验,评价两种疫苗的免疫效果。结果表明,两种佐剂疫苗均能够诱导小鼠和犬产生较强的免疫应答反应,二免后14 d,免疫犬抗体水平均高于1∶40;攻毒试验中,疫苗免疫可以显著减轻病毒感染犬临床症状,明显缩短病毒的排毒期,特异性抗体水平显著提高。本研究研制了两种佐剂H3N2亚型犬流感灭活疫苗,为犬流感的防制提供保障。

长臂猿感染H9N2亚型禽流感病毒病例报告

2022年1月,某动物园同一馆舍内饲养的6只长臂猿(Nomascus spp.)先后出现流清涕、咳嗽的症状。采集患病长臂猿鼻拭子共6份,利用高通量测序法对样本进行病原筛查,结果显示:2份样本呈AIV阳性,序列组装结果与H9N2亚型禽流感病毒的相似性最高;采用qPCR法对2份阳性样本进行H1~H16基因和N1~N9基因检测验证,发现5号样本H9 Ct值为31.35、N2 Ct值为36.16,6号样本H9 Ct值为27.46、N2 Ct值为29.57,均为阳性。给予患病长臂猿化痰止咳、消炎和控制继发感染等综合治疗,同时加强饲养环境消毒,患病长臂猿很快康复。

不同佐剂H3N2亚型猪流感灭活疫苗的免疫效果比较

选用福建分离猪流感A/Swine/Fujian/F1/03(H3N2)毒株为制苗种毒,制成2种不同佐剂灭活疫苗。挑选H3N2亚型猪流感抗体阴性的母猪和断奶仔猪用于检测比较2种灭活疫苗的免疫效果。结果表明:IMS1315佐剂灭活疫苗首免母猪和断奶仔猪7d后均可检测到HI抗体,二免28d后抗体水平最高,其中母猪的抗体均值为11.0Log2,断奶仔猪的抗体均值为10.2Log2,二免150d后仍维持在较高抗体水平,均值在6.5Log2以上;医用白油佐剂灭活疫苗首免母猪和断奶仔猪14d后均可检测到HI抗体,二免28d后抗体水平达最高,其中母猪的抗体均值为10.2Log2,断奶仔猪的抗体均值为10.0Log2,二免150d后抗体水平均值在6.0Log2以上。表明2种不同佐剂灭活疫苗不论免疫母猪还是仔猪,均具有较长的抗体消长期,但IMS1315佐剂灭活疫苗产生抗体略好于医用白油佐剂灭活疫苗。

H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株灭活疫苗的研制

利用H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株进行灭活疫苗的研制,并对疫苗的免疫效果进行评价,为家禽H7N9亚型流感的防控提供科学数据及手段。将AIV-rGD76株用灭菌生理盐水作104倍稀释后,接种11日龄非免疫鸡胚,37℃孵育72h后收获感染鸡胚尿囊液,经甲醛灭活后,加矿物油佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗,对制备疫苗的性状、安全性、免疫效力等进行检验。结果显示,制备的3批重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株)均为油包水型,黏度均在50cP以内,对3批疫苗取样,样品经3000r/min离心15min,管底无水相析出。安全性试验结果显示,将疫苗按1mL/只超剂量接种3周龄SPF鸡,试验鸡在观察期内全部健活,未出现局部或全身不良反应,表明疫苗对SPF鸡具有良好的安全性;免疫效力及攻毒保护试验结果显示,用疫苗按0.3mL/只的剂量免疫接种3周龄SPF鸡1次,免疫接种后21d试验鸡血清中rGD76株的HI抗体平均效价可达8log2以上,使用H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD16株滴鼻接种0.2mL/只(含100LD50)对免疫鸡进行攻毒,疫苗对免疫鸡的保护率均为100%。在实验室条件下研制出重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株),疫苗的各项指标均符合标准。