隐绿原酸对H9N2-AIV致小鼠肺损伤的免疫调节和抗氧化效果

为探讨隐绿原酸(4-CQA)对感染H9N2亚型禽流感(H9N2-AIV)病毒的小鼠造成肺损伤的修复作用,将90只6~8周龄健康昆明系小鼠随机分为病毒(H9N2)感染组、H9N2+4-CQA组、空白对照组、4-CQA对照组,用H9N2-AIV滴鼻复制小鼠肺损伤模型并灌胃4-CQA干预。观察各组小鼠肺组织病理学变化;测定肺指数及肺内丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、髓过氧化物酶(MPO)含量;测定脾内T淋巴细胞亚群CD4^(+)、CD8^(+)百分比及比率(CD4^(+)/CD8^(+))。结果显示,H9N2组小鼠表现出精神沉郁、呼吸急促;肺指数上升、脾指数下降;肺组织病理学表现为肺泡萎缩、肺泡隔增厚、局部肺实变;T淋巴细胞亚群CD4^(+)/CD8^(+)比率显著下降(P<0.05);肺内T-SOD活性显著下降、MDA含量显著增加、MPO活性显著升高(P<0.05)。4-CQA干预后,小鼠肺指数下降、脾指数上升;肺组织病理学损伤减轻;T淋巴细胞亚群CD4^(+)/CD8^(+)比率显著上升(P<0.05);肺内T-SOD活性显著升高,MDA含量显著降低,MPO活性显著下降(P<0.05)。得出4-CQA可通过维持机体免疫平衡、降低机体氧化损伤来缓解由H9N2亚型AIV诱导的小鼠肺损伤。

广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

影响H9N2亚型禽流感病毒生物学特性的关键氨基酸位点分析

H9N2亚型禽流感病毒是在我国家禽中流行最为广泛的亚型,严重影响养禽业健康发展,具有感染哺乳动物的能力。可感染人类的H5N1、H7N9、H10N8和H3N8等新型流感病毒中多次发现H9N2亚型禽流感病毒的内部基因,而这些感染人类的新型流感病毒对公共卫生安全造成了巨大威胁。文章围绕H9N2亚型禽流感病毒,总结了影响该亚型病毒致病性、受体结合、复制能力以及在家禽或哺乳动物中与传播有关的关键功能氨基酸位点突变的研究进展,以期进一步解析H9N2亚型禽流感病毒及其内部基因在新型流感病毒产生过程中的机制和作用。

两株H9N2亚型禽流感病毒受体结合特性和致病性研究

为研究临床监测中分离两株H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Henan/F1108/2019及A/chicken/Shandong/F07/2021跨种感染哺乳动物能力,试验构建了H9基因系统发生树,采用红细胞吸附试验及固相结合试验测定两株病毒受体结合特性,并通过小鼠感染试验探究两株病毒对小鼠感染性及致病性。结果显示:A/chicken/Henan/F1108/2019及A/chicken/Shandong/F07/2021与近些年人及禽分离毒株进化关系较近;A/chicken/Henan/F1108/2019主要结合α-2,3唾液酸,而A/chicken/Shandong/F07/2021主要结合α-2,6唾液酸;A/chicken/Henan/F1108/2019在小鼠鼻甲及肺脏中的复制能力及致病性均强于A/chicken/Shandong/F07/2021。研究表明具有α-2,3唾液酸受体结合特性的H9N2亚型禽流感病毒在鸡群中仍然存在,且分离株对小鼠具有较强的致病性。

云南野鸟源H9N2亚型AIV的遗传进化分析

【目的】分析云南纳帕海国际重要湿地H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的遗传进化和分子特征,掌握H9N2亚型AIV在野禽中的流行特点,为禽流感疫情防控提供数据支持。【方法】采集2022―2023年云南省香格里拉纳帕海国际重要湿地野禽粪样及其周边家禽喉头、泄殖腔和环境水样,经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚分离病毒,结合HA试验和RT-PCR扩增鉴定AIV亚型。利用MBTuni-12/13引物同时扩增H9N2亚型AIV毒株的8个基因(HA、NA、M、PB2、NS、NP、PA及PB1)节段,利用二代测序获取全基因组序列,并分析遗传进化关系及关键氨基酸突变位点。【结果】分离到的4株野鸟源H9N2亚型AIV的HA、NA基因源自Y280-like亚系,M、PB 2基因为G1-like亚系,NS、NP、PA、PB 1基因为F/98-like亚系,表明4株分离株为多种亚型的重组毒株,重组模式与2013年以后在中国流行的G57基因型一致。序列相似性分析结果显示,4株H9N2亚型AIV分离株内部基因与H7N9、H5N6、H5N2等亚型AIV相似性较高,遗传多样性特征突出。HA蛋白裂解位点均符合低致病性禽流感特征,获得了多个可增加跨种感染风险及与哺乳动物致病力增强相关的氨基酸突变位点,包括A198T、Q234L、N166D(HA),I292V、A558V(PB2),I368V、L13P(PB1),N30D、T215A(M1),以及P42S(NS1)等。4株野鸟源H9N2亚型AIV毒株具有家禽源同亚型毒株特征,野禽源AIV可能源于家禽。【结论】从云南纳帕海国际重要湿地分离到的4株野鸟源H9N2亚型AIV可能是由家禽传播的多源重配病毒,属于G57基因型,且具有多个适应哺乳动物宿主相关的氨基酸突变位点。

空心莲子草乙酸乙酯部位体内外抗H9N2亚型禽流感病毒活性的研究

[目的]探究空心莲子草乙酸乙酯部位(ethyl acetate extract from Alternanthera philoxeroides,AETAC)体内外抗H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype Avian influenza virus, AIV-H9N2)活性及其作用机制。[方法]利用CCK-8法检测不同浓度AETAC作用不同时间对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的抑制作用,通过预防感染、影响复制、阻止吸附及直接杀灭4种方式作用后检测AETAC对DF-1细胞的毒性,选择体外最佳抗AIV-H9N2作用方式。尿囊腔接种不同浓度AETAC确定其对鸡胚的最大安全浓度;将AETAC以3种不同给药方式作用于AIV-H9N2感染后鸡胚,选择体内最佳给药方式。经尿囊腔同时接种AETAC和AIV-H9N2,统计各组鸡胚存活数,测定血凝效价,并观察胚胎的发育情况和鸡胚法氏囊病理组织变化。[结果]在一定范围内,随着AETAC浓度升高或作用时间延长,AETAC对DF-1细胞的抑制率升高。与空白对照组相比,4种抗AIV-H9N2作用方式下,病毒对照组和药物组细胞存活率均显著降低(P<0.05);与病毒对照组相比,AETAC浓度为5~30μg/mL时,4种抗AIV-H9N2作用方式下,药物组细胞存活率均显著升高(P<0.05)。4种作用方式下,DF-1细胞存活率分别为8.15%~64.96%(预防感染)、8.56%~83.83%(影响复制)、1.82%~5.90%(阻止吸附)和6.90%~40.12%(直接杀灭)。AETAC对鸡胚的最大安全浓度为16.41 mg/mL,对感染鸡胚的最佳给药方式为AETAC和病毒混合后接种。以最佳体内作用方式给药后,AETAC中、低浓度组鸡胚存活率为40%~60%,高浓度组鸡胚全部存活,胚胎喙部发育明显,鸡胚法氏囊淋巴滤泡发育完整,滤泡大小和数量正常,充血量少,组织病理状态改善。[结论]AETAC在体内外对AIV-H9N2均具有显著的抑制作用,且主要与影响病毒复制作用方式相关。

H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因在昆虫细胞中的表达

为通过昆虫细胞表达出H9N2亚型禽流感病毒M1和NA蛋白,并鉴定其免疫活性,利用PCR技术扩增H9N2亚型禽流感病毒M1和NA基因,以pFastBacDual为转移载体构建重组转移载体pFastBacDual-M1和pFastBacDual-NA;将阳性重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞,得到重组杆粒rBacmid-M1和rBacmid-NA;将重组杆粒分别转染Sf9昆虫细胞,获得含M1和NA基因的重组杆状病毒rBV-M1和rBV-NA;运用IFA和Western-blot鉴定M1和NA蛋白的表达情况,同时以NA蛋白为包被抗原,运用间接ELISA方法鉴定NA蛋白的反应活性。结果显示,IFA鉴定均出现特异性绿色荧光,Western-blot检测M1和NA蛋白大小分别约为28和52 ku,ELISA检测NA蛋白对抗H9N2阳性血清有很高的反应值。结果表明,M1和NA蛋白可在昆虫细胞中特异性表达且具有反应原性。本试验为进一步研发H9N2亚型禽流感诊断技术和疫苗奠定了基础。

商品疫苗对我国h9.4.2.5分支H9N2亚型禽流感分离株的免疫保护

【目的】我国批准使用的H9亚型禽流感(avian influenza,AI)商品化灭活疫苗种类繁多,其免疫效果和选用受到养殖者的广泛关注。通过评估不同商品疫苗对我国近期H9N2亚型AIV的免疫保护效果,以期为H9亚型AIV的免疫防控提供科学参考。【方法】依据国家兽药基础数据库疫苗批签发数据,从在售的40种H9亚型AI商品疫苗中选择批签发数量较多的4种疫苗(A—D疫苗),进行免疫攻毒试验。4株h9.4.2.5分支的H9N2亚型分离株CK/XJ/S1204/2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/S4590/2020为攻毒毒株,分别测定4株病毒的鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡半数感染量(CID50)和细胞半数感染量(TCID50),以确定动物试验的攻毒剂量和细胞试验的感染剂量。每种疫苗以产品推荐剂量免疫3周龄SPF鸡各40只,同时设同日龄SPF鸡40只接种PBS作为对照组;免疫3周时,采集所有试验鸡血清,测定血凝抑制抗体(HI)和中和抗体(NT)滴度;同时将每种商品疫苗接种40只SPF鸡进行随机分组,每组10只,连同10只对照组鸡,以10 CID50的剂量鼻腔感染H9N2亚型分离株,分别进行商品疫苗对4株病毒的攻毒保护试验。采集攻毒后3、5 d喉头及泄殖腔棉拭子样品,接种10日龄鸡胚检测排毒情况,统计疫苗保护率,比较疫苗对H9N2亚型分离株的免疫保护效果。【结果】4株H9N2亚型分离株的CID50依次为10^(3.5)、10^(2.5)、10^(2.5)和10^(3.5)EID_(50)/0.1 mL。商品疫苗接种后3周,各免疫组SPF鸡血清中针对商品化H9亚型HI试验抗原(CK/SH/10/2001)的HI抗体均在9.4 log_(2)—11 log_(2)之间,但针对攻毒株的HI抗体平均效价在4.6 log_(2)—10.8 log_(2)之间,不同疫苗免疫组间存在较大差异,最大差异为64倍,各免疫组NT抗体平均效价在6.7 log_(2)—12.2 log_(2)之间,最大差异为32倍,对照组鸡的HI抗体和NT抗体均为阴性。以滴鼻方式感染不同H9病毒后,4种疫苗的免疫保护效果存在较大差别,在攻击CK/XJ/S1204/2015毒株的试验中,3种疫苗(B—D疫苗)能为免疫鸡提供80%以上保护;在攻击DK/JX/S4512/2017毒株试验中,仅1种疫苗(B疫苗)能为免疫鸡提供80%以上保护;在攻击CK/YN/S1666/2020毒株的试验中,2种疫苗(A和B疫苗)能为免疫鸡提供80%以上免疫保护;而攻击CK/NX/S4590/2020毒株,4种疫苗免疫鸡的保护率均低于80%,而同期各对照组鸡均排毒,排毒率均高于80%。【结论】不同商品疫苗预防近期H9亚型分离株感染的免疫保护效果存在较大差异,疫苗抗原与分离株之间的抗原性差异是免疫保护率降低的主要原因;使用H9N2亚型流行毒株测定免疫后的HI抗体和NT抗体可作为评价商品疫苗免疫保护效果的重要依据。本研究为商品H9疫苗的科学选用提供重要参考。

空心莲子草醇提物抗AIV-H9N2作用的研究

为了研究空心莲子草醇提物[Alternanthera philoxeroides(Mart.)Griseb.alcohol extract,AAE]的体外抗H9N2型禽流感病毒(avian Influenza virus,AIV)的效果,探索空心莲子草体外抗病毒的作用方式,试验测定了AIV-H9N2对DF-1细胞的TCID50;采用观察细胞病变联合CCK-8检测的方法,测定AAE对DF-1细胞的毒性作用;通过计算各试验组(空白对照组、病毒对照组、给药组)细胞的存活率,观察3种作用方式(预防感染作用、抑制复制作用及直接杀灭病毒作用)下,不同浓度AAE体外抗AIV-H9N2的效果,并计算治疗指数(TI)。经尿囊腔接种病毒,测定鸡胚的半数胚致死量(ELD50),测定AAE对鸡胚的最大安全浓度,然后对鸡胚进行攻毒用药试验,统计各组存活情况及血凝效价,观察胚体的发育情况。结果表明:收获的AIV-H9N2病毒液TCID50为1×10^(-4.23)/0.1 mL;AAE对DF-1细胞作用24,48小时时的CC50浓度分别为(191.52±8.73)μg/mL、(156.96±8.79)μg/mL;3种作用方式下,药物对细胞的保护率范围分别在40%~58%、4%~34%及12%~18%之间,AAE治疗指数预防病毒感染作用(3.42±0.71)大于影响病毒复制作用(1.74±0.11),AAE不具有直接杀灭病毒作用。鸡胚的ELD50为1×10^(-2.84)/0.2 mL,AAE对鸡胚的最大安全浓度为32.5 mg/mL,AAE能显著改善AIV-H9N2感染胚胎的存活情况(P<0.05),降低病毒感染的血凝效价,减弱病毒对胚体发育的影响。说明AAE在DF-1细胞和鸡胚中对AIV-H9N2具有潜在的抑制作用,可以抑制AIV-H9N2的活性。

利用8质粒系统拯救A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒

应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的8个基因片段的质粒共转染COS_1细胞,产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。将A Chicken Shanghai F 98(CK SH F 98)株H9N2亚型AIV的8个基因组cDNA分别克隆到polⅠ_polⅡ转录 表达载体pHW2 0 0 0中,构建成8个转录表达载体重组质粒。将这8个质粒共转染COS_1细胞,2 4h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,4 8h后收取鸡胚尿囊液继续进行鸡胚传代,产生能致死鸡胚的病毒。经血凝、血凝抑制试验、序列分析和电镜观察,证实产生了CK SH F 98(H9N2 )株AIV。

3株H9N2亚型禽流感病毒广西分离株全基因组序列的测定与分析

目的对3株H9N2亚型禽流感病毒进行全基因序列的测定与分析。方法根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的全基因序列,设计了8对引物,运用RT-PCR方法获取了3株H9N2亚型AIV广西地方分离株A/Chick-en/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/00的全基因序列,并对所得序列进行了比较分析。结果同源性分析及遗传进化分析发现,所分离的3个毒株的各基因与A/Chicken/Guangdong/4/00和A/Chicken/Jiangsu/1/00的相应基因的核苷酸序列有着较高的同源性和较近的亲缘关系,可能起源于同一种系。所分离毒株中每个毒株的8个基因,在遗传进化树上的分支不具有统一性,说明此3个毒株可能为不同基因亚系间发生自然重排的产物。氨基酸序列比较发现,A/Chicken/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/003株AIV的na基因核苷酸序列在开放性阅读框架的187～195位均缺失了ACAGAGATA共9个核苷酸,它们所编码的氨基酸为T、E、I。3个分离株的HA蛋白第226位氨基酸均为Gln,证明它们为人类非易感性的H9N2亚型AIV。结论此3株H9N2亚型流感病毒为基因自然重排的产物,其na基因均存在缺失,且从分子水平上证明它们对人类不具有易感性。

广西野鸟H9N2亚型流感病毒的分离与鉴定

【目的】探讨H9N2亚型流感病毒在野鸟中的存在与传播,为广西流感疫情动态监测和防控及人流感预防监测提供重要依据。【方法】采集广西野鸟肺脏组织,将病料接种于9~11日龄SPF鸡胚尿囊腔进行分离培养,血清学试验鉴定HA和NA亚型,并克隆扩增其HA和NA基因。【结果】该分离株能被H9亚型阳性血清抑制,神经氨酸酶抑制（NI）试验结果将其鉴定为N2亚型,判断该病毒属于H9N2亚型流感病毒,命名为A/wildbird/Guangxi/H2/07,对HA和NA基因进行序列分析,发现与流感病毒H9亚型和N2亚型同源性最高,分别达到82.4%~99.0%和83.1%~99.9%。【结论】H9N2亚型流感病毒已在广西野鸟中存在,该结论为广西流感疫情动态监测和防控提供了重要依据。

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

为了解不同年分离的H9N2亚型禽流感病毒（Avian infl uenza virus,AIV）之间的抗原相关性,挑选2002年、2006～2014年在上海市分离的14株H9N2亚型禽流感病毒,通过血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）交叉试验进行抗原性比较和分析。HI试验结果显示,2002年,2006～2014年这14株H9N2亚型AIV不同毒株间已经发生了抗原漂移,划分成4个不同的抗原群,A/Chicken/Shanghai/Y1/2002和A/Chicken/Shanghai/Y1/2006归为一个抗原群,A/Chicken/Shanghai/C/2011独自成为一个抗原群,A/Pigeon/Shanghai/JC1/2013、A/Chicken/Shanghai/1107/2013归为同一个抗原群,其余毒株均为一个抗原群。综上所述,随着时间的推移,H9N2 AIV抗原发生了不同程度的漂变,但是也存在在某个时间段多种抗原群共存的情况。该研究结果从理论上为上海市制定禽流感防控策略,有效防制H9N2 AIV流行提供了科学的指导,为生产H9N2亚型流感免疫与疫苗候选毒株的选择提供参考依据。

10株不同年代H9N2 AIV NA基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术克隆了10株涵盖不同分离年代和不同毒力的H9N2亚型AIV的NA基因,序列分析表明,10株AIV的NA基因的核苷酸和推导的氨基酸同源性高,进化稳定。系统进化树分析表明,其NA基因都属欧亚大陆禽分支,H9N2流感病毒的分布与地域有相关性。其NA蛋白氨基酸序列潜在的糖基化位点以及氨基酸红细胞吸附位点出现的变化尚不能解释这些毒株生物学特性上的差别。但这些研究结果从理论上丰富了H9N2亚型禽流感的分子流行病学,也为进一步研究该类毒株的进化提供了依据。

一株H9N2亚型禽流感病毒分离株的生物学特性研究及其全基因组序列分析

本试验对1株2010年从广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/QY/2010(H9N2)的生物学特性进行研究并对其全基因组序列进行分析。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量EID50为10-9/0.1mL,鸡胚最小致死量的平均死亡时间MDT为104h,脑内致病指数ICPI值为0.51,静脉致病指数IVPI为0。用RT-PCR方法扩增病毒的基因组各片段,将扩增片段进行克隆、测序并进行序列分析。结果显示,该毒株的HA基因与Ck/HK/G9/97和Dk/HK/Y280/97在同一分支上,HA的裂解位点为PARSSR↓GLF,有8个潜在糖基化位点,226位氨基酸残基为L,较保守的202位受体结合位点由L突变为P,该毒株的HA和NA核苷酸序列与Dk/HK/Y280/97同源性较高,NS、PA、PB1的核苷酸序列均与Ck/SH/F/98同源性较高,NP基因与A/VN/1203/04(H5N1)的核苷酸序列同源性为95.3%。

3种方法纯化兔抗H9N2亚型禽流感病毒血清的比较

本试验分别用蛋白G亲和层析法、饱和硫酸铵法和辛酸-硫酸铵法纯化兔抗H9N2亚型禽流感病毒血清,发现蛋白G亲和层析法纯化得到的抗体纯度最高,回收率较低,抗体活性未变,操作简便,但成本较高,适合实验室研究及小量样品的纯化;饱和硫酸铵法纯化得到的抗体纯度较蛋白G亲和层析法低一些,抗体活性不变,可通过多次盐析来提高抗体纯度,多作为蛋白G亲和层析法纯化前的初步纯化;辛酸-硫酸铵法纯化得到的抗体纯度不及前两种方法,回收率较高,抗体活性亦无改变,纯化时对pH的精确性和辛酸的浓度要求较高,多用于样品的粗提和单抗的纯化。

鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(H9N2)三联灭活疫苗的安全性研究

为证实鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(新支流)三联灭活油乳疫苗的安全性,通过颈部皮下注射接种14日龄来航鸡,每日测定鸡的体重,连续监测28 d,用t检验分析对照组和免疫组体重之间的差异显著性。试验结果表明,免疫接种组和空白对照组体重差异不显著,所制备的新支流三联疫苗不影响鸡的生长性能,对鸡安全。

H9N2禽流感病毒陕西分离株HA基因的遗传变异分析

【目的】对H9N2禽流感病毒HA基因全序列进行分析,了解H9N2禽流感分离毒株HA基因的遗传变异情况。【方法】根据GenBank已发表的H9N2毒株的基因序列,设计了2对H9N2禽流感病毒HA基因特异性引物,运用RT-PCR方法对XL、LF和WN分离株进行了扩增,然后将PCR产物送出进行测序,用DNAstar 5.0软件对测序结果进行了分析。【结果】XL、LF和WN 3株H9N2分离株间HA基因的核苷酸同源性为99.7%-99.9%,推导氨基酸的同源性为99.1%-99.6%;分离株与参考毒株HA基因核苷酸的同源性为96.2%-99.0%,推导氨基酸的同源性为96.2%-98.6%。通过对3个H9N2分离株间HA基因核苷酸序列的比较,发现共有5个位点的核苷酸发生突变,其中4个位点核苷酸的改变导致相应的氨基酸发生突变。HA蛋白的7个受体结合位点比较保守,但是其在551-553位缺失了潜在的糖基化位点。【结论】3株H9N2分离株裂解位点氨基酸序列完全符合低致病性禽流感的特征RSSR↓G,但是LF裂解位点附近333位脯氨酸（Pro）突变为组氨酸（His）,即非极性氨基酸向极性带正电氨基酸（碱性氨基酸）转变,裂解位点的变化可能是H9N2禽流感病毒生物学特性改变的分子基础。

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

【目的】明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据。【方法】从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定。【结果】从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型。分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1 d即开始排毒,第5 d为排毒高峰。【结论】从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险。

贵州H9N2亚型禽流感病毒NA基因的遗传演化特征

为探明贵州H9N2亚型禽流感病毒（AIV）的遗传演化特征,为其科学防控提供参考,通过GenBank登载H9N2亚型AIV参考毒株的神经氨酸酶（NA）基因设计引物,进行RT-PCR扩增,然后克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明：H9N2亚型禽流感病毒贵州分离株的NA基因全长为1 414bp,可编码467个氨基酸,与国内外参考毒株相应序列的核苷酸同源性在87.5%~98.1%;含有6个潜在的糖基化位点;在63~65位缺失T、E和I等3个茎部氨基酸,导致第61位糖基化位点丢失;从NA基因系统发育树看,该毒株属于欧亚种系Y280分支。