BM-MSCs来源外泌体介导铁死亡减轻大鼠心肌细胞系H9c2缺氧/复氧损伤

目的探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)来源外泌体对大鼠心肌细胞系H9c2缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用及其分子机制。方法构建H9c2细胞A/R损伤模型;采用电镜、Western blot鉴定BM-MSCs来源外泌体(BM-MSCs-exos);PHK26红色荧光标记外泌体并观察H9c2细胞内吞现象;采用CCK-8法检测细胞活力,EdU细胞增殖实验检测细胞增殖活性;铁死亡相关检测试剂盒测定Fe 2+、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量,流式细胞测量术检测活性氧自由基(ROS)水平。结果成功鉴定BM-MSCs-exo并观察到H9c2细胞内吞外泌体;与A/R组比较,A/R+BM-MSCs-exo组细胞活力与增殖能力得到明显改善(P<0.05);铁死亡标志蛋白GPX4、SLC7A11升高,转铁蛋白受体1(TFR1)表达降低(P<0.05);Fe 2+离子、MDA、ROS水平降低,GSH水平升高(P<0.05)。铁死亡诱导剂Erastin处理后,发现BM-MSCs-exo对H9c2细胞A/R损伤的保护作用显著降低(P<0.05)。结论BM-MSCs-exos可减轻A/R诱导的心肌细胞系损伤,其机制可能是通过抑制心肌细胞铁死亡介导的BM-MSCs-exos。

稳定过表达人KLHL31基因的H9c2细胞系的建立及鉴定

人类KLHL31基因是本实验室已克隆的基因,其蛋白质含有保守的BTB和串连重复的Kelch结构域,实验表明人类KLHL31在成体骨骼肌和心肌组织中特异表达,KLHL31蛋白的过表达可以抑制了AP-1与SRE的活性。本文拟利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV-tag2B-KLHL31转染H9c2细胞,通过G418筛选,RT-PCR和Western blotting验证,建立稳定过表达KLHL31基因的细胞系H9c2-KLHL31,为研究KLHL31在心脏发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型。

稳定高表达TGF-β_1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定

目的构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株。方法利用RNA干扰技术提取p EGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了p EGFP-TGF-β1质粒和p EGFP对照质粒的细胞株分为p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组。结果 p EGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的p EGFP-TGF-β1质粒组和p EGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%。RT-PCR结果显示,p EGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1m RNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,p EGFPTGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015)。结论本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究。

Klotho蛋白减轻低氧/复氧诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究Klotho蛋白对低氧-复氧诱导的心肌H9C2细胞系损伤的保护作用及其机制。方法将H9C2心肌细胞分为对照组、低氧/复氧组(1%O_2低氧6 h, 5%CO_2以及95%空气培养箱中复氧2 h)和Klotho蛋白(10μg/mL)干预组。通过酶标仪间接测定细胞内钙离子([Ca^(2+)]_i)水平;CCK8法和TUNEL法分别检测细胞活性及细胞凋亡;分光光度法检测细胞中钠ATP酶(Na^+/K^+-ATPase,NKA)和反向模式钠/钙交换体(Na^+/Ca^(2+)-exchange,NCX)的活性。结果体外培养的H9C2细胞低氧/复氧(6 h/2 h)处理后可明显降低H9C2细胞活性(P<0.05);增加细胞内Ca^(2+)水平和凋亡率(P<0.05);降低细胞中Na^+/K^+-ATPase的活性(P<0.05);增加反向模式Na^+/Ca^(2+)交换体的活性(P<0.05);10μg/mL Klotho蛋白处理可明显减轻上述损伤。结论 Klotho蛋白可减轻低氧/复氧诱导下的H9C2细胞内钙超载,最终减少该细胞系细胞的凋亡。

Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染H9c2细胞系的构建

运用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)构建pSUPER.retro-Smyd1真核表达质粒,经鉴定后用脂质体法转染H9c2细胞,通过G418筛选出稳定表达pSUPER.retro-Smyd1的细胞系,最后经Western blot及RT-PCR实验鉴定其干扰效果。经鉴定,通过H9c2细胞系构建的pSUPER.retro-Smyd1干扰细胞系的干扰效果显著。因此,本实验成功构建了Smyd1干扰真核表达质粒及其稳定转染的H9c2细胞系,为进一步研究Smyd1基因在心脏发育中的作用奠定了良好的实验基础。

奥氮平增加大鼠H9C2心肌细胞巨噬细胞迁移抑制因子基因和蛋白表达

目的通过奥氮平处理心肌细胞来探讨奥氮平诱导心血管疾病的机制。方法用不同浓度(10,20和40uM)及不同作用时间(1,3,12和24 h)的奥氮平处理大鼠心肌细胞H9C2,检测巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在mRNA及蛋白水平的表达。结果用不同浓度、不同时间的奥氮平处理H9c2细胞时,随着处理浓度的增加及时间的延长,MIF mRNA及MIF蛋白随着浓度的递增及时间的延长而增高(P<0.05)。结论奥氮平处理心肌细胞后,MIF的mRNA及蛋白均发生显著改变,这种改变存在浓度与时间的依赖关系,MIF可能参与奥氮平诱导的心血管系统损伤。

稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定

目的:建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作用提供细胞模型。方法:将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染技术导入H9C2细胞,使核仁素在细胞内表达,用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株;用双酶切、DNA测序鉴定质粒,用RT-PCR及Western blot检测核仁素基因在靶细胞中的整合与表达。结果:经G418反复筛选的H9C2细胞株中,核仁素基因在mRNA及蛋白质水平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。结论:用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠心肌细胞,经筛选后可稳定表达核仁素。

靶向CrkL基因的siRNA真核表达载体的构建及对H9C2心肌细胞凋亡的作用

为研究CrkL基因在心肌细胞中的作用机制提供实验基础,首先体外合成6个针对大鼠CrkL基因的特异反义脱氧寡核苷酸序列,定向克隆至pSR-GFP/neo siRNA真核表达质粒中,经双酶切和测序证实重组载体pSR-GFP/neo-CrkLi构建成功.然后将其转染入大鼠H9C2心肌细胞内,用荧光显微镜观察其转染率,RT-PCR法鉴定其对CrkL mRNA表达的抑制作用.流式细胞仪检测转染前后H9C2细胞凋亡率.所有pSR-GFP/neo-CrkLi载体均能高效率的转染H9C2细胞,但只有3个载体能显著抑制CrkL mRNA的表达.其中pSR-GFP/neo-CrkLi3效果最佳,其转染H9C2细胞后,该组H9C2细胞凋亡率明显高于其他两组(P=0.001).

细胞穿透肽PEP-1介导过氧化氢酶转导大鼠心肌H9C2细胞

目的:探索细胞穿透肽PEP-1介导的人过氧化氢酶转导入H9C2细胞的能力。方法:利用基因工程方法表达和纯化His-tag-PEP-1-CAT及His-tag-CAT融合蛋白后,与体外培养的H9C2细胞株共孵育,利用免疫细胞荧光技术和Westernblot检测PEP-1-CAT融合蛋白是否转导入H9C2细胞内;并检测H9C2细胞内的过氧化氢酶活性。结果:制备的PEP-1-CAT融合蛋白纯度为90%以上,其浓度达0.501mg/mL;PEP-1介导的CAT融合蛋白能高效转导入H9C2细胞内,呈时间及剂量依赖性,6h时达峰值;转导入H9C2细胞内的融合蛋白的过氧化氢酶活性亦呈现出时间及剂量依赖的特点。结论:PEP-1-CAT能高效稳定转导入H9C2细胞内,为PEP-1介导的过氧化氢酶防治心肌缺血/再灌注损伤研究奠定基础。

基于氧化应激探索木犀草素对缺氧-复氧损害的H9c2心肌细胞的保护作用

目的基于氧化应激探索木犀草素对缺氧-复氧损害的H9c2心肌细胞的保护作用。方法在体外木犀草素培养后,再缺氧-复氧培养H9c2心肌细胞模拟缺血再灌注为实验组,以正常培养细胞为对照组,以仅缺氧-复氧培养细胞为缺氧-复氧组。观察细胞形态;流式检测细胞凋亡情况;生化检测细胞丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、谷胱甘肽(GSH)含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)、血红素加氧酶(HO-1)、NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO1)mRNA表达;蛋白质印迹法(Western Blot)检测细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Kelch样ECH关联蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白含量。结果缺氧-复氧诱导H9c2细胞凋亡[(8.14±1.13)比(72.37±6.98),t=15.733,P=0.000]及促进Bax蛋白表达[(0.38±0.04)比(1.01±0.09),t=11.079,P=0.000],抑制Bcl-2蛋白表达[(0.83±0.06)比0.43±0.04,t=9.608,P=0.001],木犀草素可浓度依赖的抑制细胞凋亡[(72.37±6.98)比(41.38±4.32)、(29.67±5.67),t1=6.539,P=0.003;t2=8.224,P=0.001]及Bax蛋白表达[(1.01±0.09)比(0.71±0.06)、(0.45±0.03),t1=4.979,P=0.008;t2=10.224,P=0.001],增加Bcl-2蛋白表达[(0.43±0.04)比(0.63±0.04)、(0.74±0.05),t1=6.124,P=0.004;t2=8.386,P=0.001];在氧化应激层面,木犀草素可降低由缺氧-复氧引起的MDA、8-OHdG升高[MDA:(1.73±0.12)nmol/mg比(1.12±0.11)nmol/mg、(0.82±0.06)nmol/mg、(0.63±0.04)nmol/mg,t1=5.879,P=0.004;t2=11.748,P=0.000;t3=15.062,P=0.000;8-OHdG:(316.37±21.53)ng/L比(253.26±19.33)ng/L、(211.45±20.98)ng/L、(189.15±18.01)ng/L,t1=3.778,P=0.019;t2=6.054,P=0.004;t3=7.850,P=0.001],升高由缺氧-复氧引起的GSH含量[(88.59±7.99)nmol/mg比(142.19±12.31)nmol/mg、(178.67±16.78)nmol/mg,t1=6.326,P=0.003;t2=8.395,P=0.001]以及γ-GCS、HO-1、NQO1 mRNA的表达下调[γ-GCS:(0.67±0.07)比(0.85±0.07)、(1.02±0.11),t1=3.149,P=0.035;t2=4.649,P=0.010;HO-1:(0.41±0.03)比(0.63±0.06)、(0.82±0.07)、(0.95±0.10),t1=5.945,P=0.004;t2=9.624,P=0.001;t3=9.126,P=0.001;NQO1:(0.51±0.04)比(0.73±0.06)、(0.82±0.08)、(1.15±0.12),t1=5.284,P=0.006;t2=6.003,P=0.004;t3=8.764,P=0.001];进一步发现木犀草素可导致Nrf2蛋白的进一步升高[(0.62±0.05)比(0.85±0.07)、(0.97±0.08),t1=4.631,P=0.010;t2=6.426,P=0.003]以及Keap1进一步下调[(0.72±0.04)比(0.28±0.02)、(0.15±0.01),t1=17.041,P=0.000;t2=23.945,P=0.000]。结论木犀草素可作用于Nrf2-(抗氧化响应元件)ARE通路,激活该信号通路后,可增加H9c2细胞中抗氧自由基酶的表达量,并降低由缺氧-复氧培养所引起的H9c2细胞的氧化应激水平,抑制心肌细胞凋亡,保护心肌细胞免受缺氧-复氧损伤。

大鼠心肌细胞和心肌细胞系H9C2表达弹性蛋白

目的检测弹性蛋白在大鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞系内的表达。方法取新生和成年SD大鼠各5例的新鲜心脏,冷冻切片;取20只新生3 d SD大鼠心脏,通过0.05%胰蛋白酶和0.075%Ⅱ型胶原酶消化法,获取原代心肌细胞;免疫组织化学和免疫荧光技术检测大鼠心肌组织、原代心肌细胞和H9C2心肌细胞系的弹性蛋白表达;ELISA法检测培养的H9C2心肌细胞系上清中的弹性蛋白。结果在大鼠心肌细胞、H9C2心肌细胞系和新生、成年大鼠心肌组织上均发现心肌肌钙蛋白T和弹性蛋白的共表达。免疫组织化学结果发现,弹性蛋白在成纤维细胞、平滑肌细胞和细胞间质内均有表达。H9C2心肌细胞培养液的上清中检测到少量的弹性蛋白。结论大鼠心肌细胞表达弹性蛋白,可能参与心肌细胞的势能和细胞间质弹性纤维的构建。

当归多糖促进大鼠心肌细胞系H9c2增殖

目的研究当归多糖(APS)对大鼠心肌细胞系H9c2增殖和凋亡的影响。方法将大鼠心肌细胞系H9c2分为对照组(control组)、阿霉素(ADR)诱导H9c2细胞复制扩张性心肌病心肌细胞组(ADR组)、APS干预(APS组)、转染anti-miR-NC(APS+anti-miR-NC组)及转染anti-miR-4701-3p(APS+anti-miR-4701-3p组)。采用流式细胞计量术检测细胞凋亡,Western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞核相关抗原Ki-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达,酶联免疫(ELISA)法检测B型脑钠肽(BNP)水平,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞的增殖,实时定量PCR(RT-qPCR)检测微小RNA-4701-3p(miR-4701-3p)表达。结果阿霉素明显提高H9c2细胞的BNP含量、细胞凋亡率、Bax蛋白水平,显著降低Bcl-2蛋白表达量(P<0.05)。当归多糖明显增加阿霉素诱导后H9c2细胞的细胞活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量和miR-4701-3p表达量,显著减少细胞的凋亡率、Bax蛋白表达量(P<0.05)。敲减miR-4701-3p明显降低当归多糖作用的扩张性心肌病H9c2细胞的细胞活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平,而显著提高其凋亡率、Bax蛋白表达量(P<0.05)。结论当归多糖通过上调miR-4701-3p的表达,促进阿霉素诱导的扩张性心肌病大鼠心肌细胞系H9c2增殖。

基于H9C2细胞株的ADRB1基因多态性稳定过表达模型的构建

目的构建β1肾上腺素能受体(ADRB1,1165G>C)基因多态性稳定过表达的心肌细胞模型,为其在高血压、心力衰竭及不良心血管事件中的功能及机制研究奠定了实验基础。方法将ADRB1cDNA克隆片段和PMT399载体连接后获得pSE4077和pSE4078重组质粒,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收集上清液感染H9C2细胞,利用定量聚合酶链式反应(QPCR)方法筛选稳转细胞株。结果pSE4077和pSE4078组的ADRB1蛋白表达水平显著高于未转染的细胞对照组和转染空病毒的对照组,且pSE4078组也高于pSE4077组。结论基于H9C2细胞株的ADRB1基多态性稳定过表达模型构建成功。

三参通脉合剂通过上调microRNA-146a改善大鼠心肌细胞H9C2的氧化损伤

目的 探讨三参通脉(Sanshentongmai, SSTM)合剂调节微小RNA-146a(microRNA-146a)对大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤的影响及作用机制。方法 体外培养大鼠心肌细胞H9C2,过氧化氢(H_(2)O_(2))作为氧化剂制作H9C2氧化应激模型。通过三参通脉干预,观察H_(2)O_(2)诱导的H9C2细胞氧化损伤的变化以及microRNA-146a的表达,探讨三参通脉对H9C2的保护作用及其作用机制。将体外培养的H9C2分为空白组、H_(2)O_(2)氧化损伤模型组(简称模型组)、H_(2)O_(2)模型+三参通脉药物(500μg/mL,处理72 h)组(简称模型加药组)。通过细胞计数试剂盒CCK8检测细胞活力,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清N端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NtproBNP)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, Hs-CRP)和血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ)水平,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测系统检测microRNA-146a表达水平。结果 通过CCK8法检测细胞活力,发现在药物质量浓度为500μg/mL时,细胞增殖改善达到顶峰,故选用此浓度为干预浓度。ELISA检测的心衰相关指标:Nt-proBNP、NO、Hs-CRP、angiotensinⅡ水平中,与空白组比较,模型加药物组中Nt-proBNP、angiotensinⅡ表达上调(P<0.05),NO表达下调(P<0.05),Hs-CRP与空白组比较表达差异无统计学意义,说明三参通脉可以有效改善大鼠心肌细胞H9C2氧化损伤。最后,RT-PCR法检测microRNA-146a在各组的表达可以看出,15μmol/L H_(2)O_(2)处理可以明显降低microRNA-146a表达,而模型加药组中microRNA-146a表达较模型组升高(P<0.05),与空白组对比差异无统计学意义。结论 三参通脉可以明显抵抗H_(2)O_(2)诱导的H9C2细胞氧化损伤,可能是通过上调microRNA-146a从而发挥心肌保护作用。

血管紧张素Ⅱ通过CaMKⅡ诱导心肌细胞自噬

目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞肥大过程中是否有细胞自噬的参与,以及钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在该过程中的作用。方法 体外培养H9C2细胞系,将细胞随机分为正常对照组、AngⅡ处理组、坎地沙坦处理AngⅡ组、KN-62处理AngⅡ组。通过激光共聚焦观察心肌细胞肥大情况;荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测CaMKⅡmRNA表达情况;Western blot检测CaMKⅡ蛋白及相关蛋白(LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1)的水平。结果 AngⅡ能够诱导心肌细胞肥大。与正常对照组相比,AngⅡ处理组CaMKⅡmRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05);坎地沙坦能够抑制AngⅡ诱导的CaMKⅡmRNA及蛋白表达升高(P<0.05)。与正常对照组相比,AngⅡ处理组的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平明显升高(P<0.05);坎地沙坦和KN-62均能降低LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白水平(P<0.05)。结论 CaMKⅡ可能不仅参与AngⅡ诱导心肌肥大,而且参与细胞自噬。

藤黄酸的心脏毒性及其基于细胞表型的多指标量化表征

目的建立基于细胞表型心脏毒性多指标同步量化表征方法,评价广谱抗癌药藤黄酸的心脏毒性。方法采用H9c2心肌细胞系,以多柔比星(Dox)和胺碘酮(Ami)为阳性药对照,1‰DMSO为溶剂对照组,次乌头碱为阴性对照组,应用高内涵分析多通道活细胞成像,收集细胞形态变化以及各指标探针的荧光强度,考察1×10-14~1×10-8mol·L^(-1)浓度范围药物对心肌细胞存活率、细胞核、线粒体形态和功能及胞内钙离子含量的影响,以药物半数有效量(EC50)判断药物对心肌细胞影响程度,以Z′值判断所建方法的精密度和假阳性率。结果 Dox降低细胞数,导致细胞核胀大,线粒体质量增加,EC50分别为0.72,0.014和1.21μmol·L^(-1),且在浓度为10μmol·L^(-1)时导致胞内钙稳态失衡。Ami导致心肌细胞数下降,细胞核缩小及线粒体质量减少,EC50值分别为14.83,6.72和4.54μmol·L^(-1),高通量筛选Z′值平均为0.5。次乌头碱对心肌细胞的细胞核和胞内钙离子含量无影响,但改变了线粒体的纹理,纹理分析值降低。藤黄酸对心肌细胞有严重的杀伤作用,使细胞存活率下降,细胞核减小以及胞内钙离子浓度降低,EC50分别为0.24,1.16和0.41μmol·L^(-1)。藤黄酸使线粒体质量降低,线粒体纹理数值降低以及线粒体面积增加,EC50分别为1.21,0.99和0.44μmol·L^(-1)。结论使用高内涵分析多通道活细胞成像技术所评价的阳性药EC50效量和现有报道接近;多指标同步量化对藤黄酸的心脏毒性进行了较为全面的分析,并对其毒性作用机制做出初步的判断。

蒽环类药物心肌损害的体外实验

目的研究蒽环类化疗药物对心肌细胞的损害作用。方法体外传代培养H9c2乳鼠心肌细胞株,细胞传代第3天加入蒽环类药物柔红霉素(DNR)共培养,测定细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)浓度,以反映心肌细胞膜损害程度;采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法检测心肌细胞生长抑制率,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。结果①DNR1组、DNR2组、DNR3组的H9c2细胞生长抑制率分别为(24.93±1.52)%、(17.15±2.03)%和(13.48±2.26)%,3组间差异有统计学意义(P<0.01)。②DNR1、DNR2、DNR3组H9c2细胞上清液的LDH浓度分别为(77.00±6.24)、(64.3±10.50)和(5 7.67±7.24)U,均显著高于空白对照组的(37.00±6.56)U(P值均<0.01)。③DNR1、DNR2、DNR3组的H9c2细胞凋亡率分别为(15.47±2.46)%、(9.82±2.08)%和(9.43±1.63)%,均显著高于空白对照组的(4.49±2.96)%(P值均<0.05)。结论DNR能抑制心肌细胞生长,促进凋亡,同时具有对心肌细胞膜的损害作用。

微小RNA对心肌细胞C反应蛋白功能水平的调节

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)基因调节机制对冠心病标志性分子C反应蛋白(CRP)的调节。方法以大鼠心肌细胞H9c2(2-1)为实验对象,在培养中进行miR312的增强和抑制处理:加入Pre-miR-132作为miR-132增强剂,Pre-miR miRNA前体分子阴性对照1号作为增强处理的对照;加入Anti-miR-132作为miRNA-132抑制剂,Anti-miR miRNA抑制剂阴性对照1号作为抑制处理的对照。用iFect转染后培养48 h,收集细胞进行CRP的蛋白免疫印迹杂交。结果大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)在增强剂Pre-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平明显下降(t-检验,P=0.013 21);与此同时,抑制剂Anti-miR-132处理48 h后,CRP蛋白水平出现了明显上升(t-检验,P=0.012 40)。结论微小RNA miR-132对大鼠心肌细胞CRP功能水平具有显著的调节作用,二者呈负相关关系。

左西孟旦通过调控EGOT/微小RNA-641对缺氧/复氧心肌细胞纤维化的影响

目的 探讨左西孟旦(Lev)是否通过调控长链非编码RNA(LncRNA)嗜酸性粒细胞个体发育转录本(EGOT)/微小RNA(miR)-641分子轴从而影响缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞增殖、凋亡及纤维化。方法 体外培养大鼠心肌细胞系H9C2,H/R处理细胞建立细胞损伤模型,随机分为对照(control)组、H/R组、H/R+Lev 1μmol/L (H/R+Lev-L)组、H/R+Lev 5μmol/L(H/R+Lev-M)组和H/R+Lev 10μmol/L(H/R+Lev-H)组,每组9例;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;Real-time PCR检测EGOT、miR-641的mRNA表达水平;分别将pcDNA-EGOT、EGOT小分子干扰RNA(si-EGOT)转染至H9C2细胞,采用上述方法检测细胞增殖及凋亡率;双荧光素酶报告基因实验验证EGOT和miR-641的靶向关系;Western blotting检测Bax、Bcl-2、胶原蛋白Ⅰ型(ColⅠ)、胶原蛋白Ⅲ型(ColⅢ)、组织金属蛋白酶抑制因子2(TIMP2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达。结果 与control组比较,H/R组细胞存活率降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),Bax、ColⅠ、ColⅢ、TIMP2和MMP-2蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),EGOT的表达水平降低(P<0.05),miR-641的表达水平升高(P<0.05);与H/R组比较,H/R+Lev-L组、H/R+Lev-M组及H/R+Lev-H组细胞存活率升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),Bax、ColⅠ、ColⅢ、TIMP2和MMP-2蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),EGOT的表达水平升高(P<0.05),miR-641的表达水平降低(P<0.05),且H/R+Lev-L组、H/R+Lev-M组、H/R+Lev-H组各指标比较差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实EGOT可靶向结合miR-641;转染pcDNA-EGOT与Lev的作用相似;转染si-EGOT可降低Lev对H/R诱导的H9C2细胞增殖、凋亡及纤维化的作用。结论 左西孟旦可能通过上调EGOT表达及下调miR-641表达而促进H/R诱导的H9C2细胞增殖及抑制细胞凋亡、纤维化。

心肌细胞株的特性及其在心血管疾病研究中的应用

心肌细胞株是研究心血管疾病发病机制和药物筛选的重要材料,不同的心肌细胞株其生物学特性存在较大差异。在心血管疾病研究中,心肌细胞株的选择与研究结果密切相关。现围绕当前心肌细胞株的生物学特性及其在研究中的应用展开综述,并提出了研究展望,以进一步拓展对于心肌细胞株的认识,为心血管疾病研究提供参考。