影响产蛋下降综合征H_(91)疫苗株HA效价的因素

鸡产蛋下降综合征（ＥＤＳ－７６）Ｈ９１－１疫苗株ＨＡ效价受接种种毒的浓度和收获时间、鸡红细胞浓度、ＨＡ反应温度、灭活用甲醛溶液浓度、灭活尿囊液存放时间等因素影响。

3株H1N1亚型猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原特异性分析

【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息,制备全病毒灭活疫苗,各免疫3只雌性新西兰大白兔,采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)反应试验检测抗体滴度。【结果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%,各分支的HA基因的抗原表位存在差异;3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上,且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应,而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。【结论】3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异,可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好,可作为候选疫苗株。

云南省鸽新城疫病毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从疑为鸽新城疫的云南省某信鸽场分离到一株毒株。该毒株能凝集鸡红细胞 ,且其凝集作用能被抗新城疫阳性血清抑制 ;该毒株对氯仿、酸敏感 ;在病毒中和试验中 ,抗NDV阳性血清对该毒株中和效价为 1∶2 1.75;将病毒分离物回归鸽子 ,复制出与自然病例相似的临床症状 ,且全部感染鸽都发生了血清学抗体转换 ;静脉接种 6周龄雏鸡 ,10天后HI价显著增高 ,且其IVPI为 0。试验结果表明该毒株为鸽新城疫病毒。

兔出血症病毒体外复制的研究

在几种动物细胞上,采用同步感染的方法研究了兔出血症病毒(RHDV)的复制特性。病毒感染细胞后(PI)48—72小时可观察到明显的细胞病变,血凝效价可增高5—10倍。病毒对细胞传代代数不同,敏感性也不同。在兔婴肾(RK)和兔婴肺(RL)细胞上以4—8代最为敏感。采用免疫荧光染色法,经病毒感染48—72小时的细胞中可观察到特异性荧光。细胞增殖的病毒经PEG-DS浓缩,Sepharose 4B柱层析提纯后,在电镜下可观察到完整的病毒粒子,将此病毒回接健康实验兔可致100％死亡。免疫双扩散和免疫电泳试验表明,细胞增殖的病毒抗原与来自病兔肝的RHDV抗血清之间产生明显的沉淀带。SDS-PAGE分析病毒获得四条多肽,其分子量大小与病兔肝组织提取的病毒蛋白多肽分子量相比略有差异。

鹅副粘病毒不同分离株的血凝特性及LD_(50)比较

用分离鉴定的 11株鹅副粘病毒分别在 SPF鸡胚传代至 2～ 11代后，用鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑五种禽类的红细胞作血凝试验，证明 11株病毒均不同程度地凝集五种禽类的红血球。同时， 10株病毒 LD50在 10－ 8～ 10－ 10之间。

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

【目的】制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持。【方法】以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。【结果】经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为2~7~2^(10),腹水HI效价为2^(16)~2^(19);单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于Ig G1亚类,其轻链均为K链。3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应。3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好。【结论】用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性。

鸡减蛋综合征灭活抗原不同保存方式的分析比较

为比较不同保存方式对鸡减蛋综合征灭活抗原的影响,采用禽腺病毒京911株(CVCC AV70)经尿囊腔接种易感鸭胚,收获感染鸭胚液,经β-丙内酯灭活后,对该抗原的保存条件及其稳定性等方面进行优化。冻干抗原与未冻干抗原在相同温度下,冻干抗原HA效价下降较慢。冻干抗原在2~8℃和-15℃以下保存,HA效价没有明显差异。因此,生产的鸡减蛋综合征灭活抗原要在冻干后保存在2~8℃最佳。保存条件的优化不仅可以减少经济损失,而且还有助于更好的控制禽腺病毒疫情的暴发。

重组鸡α-干扰素对新城疫病毒复制的影响

毕赤酵母表达鸡α-干扰素经纯化后,以50000U、5000U和500U分别与200ELD50新城疫病毒疫苗株LaSota和中等毒力Q株等量混合,接种9～10日龄SPF鸡胚,记录鸡胚死亡情况并测定尿囊液HA效价,结果表明,高浓度重组干扰素可使病毒致死鸡胚时间延长,并使Q株在尿囊液中的HA效价下降2～3个滴度。

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI)0.01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384~448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化;HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。

KMB_(17)细胞培养流感病毒的实验研究

探讨了流感病毒在KMB17细胞上培养的可行性.将3株不同型别的流感病毒(A/Wisconsin/67/2005H3N2,A/New Caledonia/20/1999 H1N1和B/Malaysia/2506/2004)分别接种于KMB17细胞上,在无血清的条件下于不同pH值和不同胰酶浓度的维持液中35℃培养72 h后收获病毒,测定血凝效价.实验结果表明,所用的3个毒株中的H3N2亚型毒株(A/Wisconsin/67/2005 H3N2)血凝效价明显高于另外的H1N1亚型(A/NewCaledonia/20/1999 H1N1)和B型(B/Malaysia/2506/2004)毒株.因此认为KMB17细胞可作为培养流感病毒的备选培养基质.

人免疫球蛋白中甲肝抗体效价ELISA检测方法的建立及验证

目的建立人免疫球蛋白产品中甲肝抗体效价ELISA检测方法,并对该方法进行验证及初步应用,以期满足《中国药典》三部(2015版)对人免疫球蛋白产品中甲肝抗体效价的质量控制检测要求。方法将人免疫球蛋白甲肝抗体国际标准品(97/646)稀释后,采用建立的ELISA法检测甲肝抗体效价,分别验证方法的线性、准确性和精密度,试验均重复3次。应用建立的方法检测我国3家企业共13批人免疫球蛋白产品中的甲肝抗体效价。结果甲肝抗体效价在10~50 m IU/ml浓度范围内线性良好,相关系数为0.994 8;用建立的方法检测浓度为15、25、35 m IU/ml人免疫球蛋白甲肝抗体国际标准品的回收率在86.9%~104.4%之间,3次测定结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于10%。用建立的方法检测我国3家企业共13批人免疫球蛋白产品中的甲肝抗体效价,结果均低于《中国药典》三部(2015版)对甲肝抗体效价不低于100 IU/ml的新增要求。结论建立的ELISA方法快速、准确,可用于检测我国人免疫球蛋白产品的甲肝抗体效价。

新复苏MDCK细胞培养甲型H3N2流感病毒方法的优化

目的优化甲型H3N2流感病毒在新复苏的犬肾细胞(MDCK)上的培养条件,提高该病毒在新复苏细胞上培养的分离效果。方法选取6例复核鉴定过的甲型H3N2病毒株,以吸附法分别接种于新复苏的MDCK细胞上培养,检测收获病毒液HA滴度,通过比较不同的细胞胞龄、细胞代次、病毒接种吸附时间对甲型H3N2流感病毒易感性的影响,确定最佳培养条件。结果不同胞龄MDCK细胞接种H3N2病毒后,胞龄为3 d、4 d的细胞所收获的病毒液HA滴度均明显高于其他组,差异有统计学意义(F=1. 279,P=0. 027);对复苏后第2代、第3代、第4代细胞进行接种后,H3N2病毒HA均明显高于第一代细胞,差异有统计学意义(F=0. 765,P=0. 008);病毒接种吸附时间(1～2 h)对甲型H3N2病毒HA滴度没有明显影响,差异无统计学意义(F=2. 743,P=0. 178)。结论甲型H3N2病毒接种于新复苏MDCK细胞最佳培养条件为:选用复苏后传代培养至第二代及以后、胞龄3～4 d的MDCK细胞进行接种,接种吸附时间1～2 h之内,可获得HA滴度较高的甲型H3N2流感病毒液。

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)、胰酶终浓度(2.5、5、7.5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10^4、100×10^4、300×10^4、500×10^4、700×10^4个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10^-2、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10^4个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度(CCID50)均明显高于贴壁培养的MDCK细胞(P<0.05)。结论优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件,为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。