流感病毒快速诊断试剂中HA抗原热稳定性的研究

[目的]筛选流感病毒HA抗原保护剂。[方法]将H3N2和H1N1亚型流感病毒分别加入A～F组中,在37℃下进行加速试验,并通过血凝试验测定HA滴度。[结果]在28 d A组(添加PBS缓冲液)中H3N2和H1N1亚型流感病毒的HA抗原血凝滴度分别为20和32。F组(添加BSA、岩藻糖、Proclin 300、Triton 100)HA抗原的热稳定性最好,在28 d H3N2和H1N1亚型流感病毒HA抗原血凝滴度分别为48和96。[结论]F组成分对流感病毒HA抗原的保护作用最好,可作为保护剂候选配方。

运用单克隆抗体分析流感病毒H1亚型HA蛋白的抗原表位

目的对甲型流感病毒H1亚型血凝素蛋白的抗原表位进行分析。方法以前期获得的97株抗H1亚型HA抗原的单克隆抗体为研究工具,用间接ELISA方法对不同亚型的血凝素抗原进行反应,将H1亚型HA蛋白的抗原表位进行粗分类,用ELISA阻断试验对抗原表位进行细分类。选取两类抗原表位的抗体,通过计算机模拟分析抗体与抗原结合的结构域,推测抗体结合的具体氨基酸位点。结果根据抗体的交叉反应性不同,将流感病毒H1亚型的HA的抗原表位分为8类;根据ELISA阻断试验的初步结果,H1亚型HA抗原的抗原表位又被细分为15类,通过计算机模拟分析预测的抗体与流感病毒HA抗原结合的氨基酸位点结果与ELISA阻断试验结果相吻合。结论证明流感病毒H1N1亚型HA抗原上至少含有15个抗原表位,且通过ELISA阻断试验和计算机模拟分析得到了相互印证,为流感病毒血凝素HA抗原表位预测方法的完善及通用疫苗的研制提供了实验数据。

H1亚型流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

目的:制备针对H1亚型流感病毒HA蛋白的单克隆抗体(mAb),并分析其反应特性。方法:分别以2009年甲型H1N1、季节性A1流感病毒裂解疫苗为免疫原,常规法免疫、融合、克隆化,获得各抗原特异性mAb。应用ELISA、HI试验和Western blot等技术研究mAb的反应性和特异性。结果:获得稳定分泌抗H1亚型流感病毒HA蛋白的杂交瘤细胞97株。其中株特异性mAb39株,29株具有HI活性;亚型特异性mAb7株,5株具有HI活性;2009年流行株与季节性A1、A3流行株共同抗原的mAb16株,9株具有HI活性;针对流感病毒共同抗原mAb35株,22株具有HI活性。结论:两种疫苗均具有较好的免疫原性和免疫保护活性,这些mAb的获得为流感病毒株特异、亚型特异性诊断试剂盒及流感病毒通用诊断试剂盒的制备提供了实验资料,为进一步研究H1N1流感病毒HA的抗原表位奠定了基础。

影响鸡IBV血凝因素及HI试验抗原制备的研究

选择没有自然血凝性的三个标准IBV毒株 (M41、Gray、T株 )和四个由西北农大禽病研究室分离的陕西省地方株〔X、Fu、W和H株 (有自然血凝性 )〕 ,在非免疫鸡胚上增殖后 ,用蔗糖透析法浓缩 10倍 ,再分别采用三种方法处理 ,制备IBV -HA抗原 :1)用浓缩 4倍的兔A型魏氏梭菌培养液滤液 (R .W .F .C4)处理IBV ;2 )用 2 .5U/mlI型磷酸酯酶C(PLC1)处理IBV ;3)用 1%胰酶处理IBV。结果显示 ,除T株仍不具有血凝性外 ,其余毒株都有了较高的血凝价。IBVM41株、X株HA效价株高达 2 8,Fu、Gray、W、H株的HA效价也达 2 7- 2 9。但是 ,用方法 3)来制备HA抗原没有任何实用价值。因为 1%胰酶本身具有非常强的非特异性凝集作用 ,非特异性HA价高达 8log2 。而采用R .W .F .C4和2 .5U/mlPLC1处理IBV浓缩毒制得的IBV -HA抗原 ,除T株外 ,均能凝集鸡红细胞 ,且该凝集作用可被特异的IBV抗血清所抑制 ,而不能被ND、EDS - 76、IBD等其它鸡病阳性血清所抑制 ,说明该抗原具有较强的特异性。本试验还对影响IBV血凝试验和血凝抑制试验的各种因素进行了研究。比较了用R .W .F .C4和用 2 .5U/mlPLC1处理IBV制备HA抗原血凝价 ,结果显示二者的血凝价是一致的 ,所以完全可以用廉价的兔A型魏氏梭菌培养液代替昂贵的PLC1作为抗原处理液。

禽流感血凝素HA超表达载体的构建及高表达百脉根的获得

为提高外源抗原蛋白的表达水平,根据已得到的HA-LTB融合基因,通过添加双增强子CaMV35S启动子、增强子Ω序列、内质网滞留信号KDEL序列及加长poly(A)序列等表达调控元件,构建HA-LTB高效融合植物表达载体。利用农杆菌介导方法转化百脉根,获得转基因阳性植株21株,经PCR和RT-PCR检测表明HA-LTB融合基因已整合到百脉根基因组中。利用ELISA检测转基因植株,结果表明LTB免疫佐剂与HA抗原蛋白均具有免疫原性,LTB最高表达量达到0.086μg/mg(蛋白粗提液),HA最高表达量达到0.25μg/mg(蛋白粗提液)。通过植物表达载体的设计和构建,使禽流感血凝素在百脉根中的表达量得到了显著提高,为禽流感可饲疫苗的研制奠定了基础。

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。

不同种类IB疫苗免疫鸡抗体消长规律的测定

我们应用已建立起来的IBV -HI方法 ,对用不同种类IB疫苗免疫鸡群 ,以及不同免疫程序的鸡群的抗体消长规律进行了监测 ,以了解免疫鸡群的抗体动态 。

德惠市当前防控禽流感的主要措施

禽流感是人畜共患病，我国规定为一类动物疫病。该病毒是正粘病毒科，其内部含单股负链的RNA，有囊膜，囊膜上有血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），是病毒亚型和毒株分类的重要依据，目前已知HA抗原有16个亚型，即H1到H16，NA抗原有9个亚型，即N1到N9，由于不同的毒株所携带的HA和NA抗原不同，因此两者组合成了众多的血清亚型，不同的血清型之间的交叉保护性很低。分为高致病力毒株和低致病力毒株，我国2005年发生的H5N1禽流感和目前发生的人H7N9禽流感对于家禽来说都属于高致病力。禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道、消化道症状，死亡率较低，或表现为较严重的全身性、出血性、败血症变化，死亡率较高。

H5N1亚型禽流感病毒HA基因在sf9细胞中的表达

本研究选用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有H5N1亚型禽流感病毒HA主要抗原基因的重组杆状病毒,并感染sf9昆虫细胞表达HA抗原蛋白。首先,分析禽流感病毒H5N1亚型HA基因编码的氨基酸序列,选取抗原表位集中特异性保守的HA序列,构建重组供体质粒p Fast HA,转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR检测,获得重组穿梭载体Bacmind HA。脂质体法转化对数生长期的sf 9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac HA。经Western-blotting检测及间接免疫荧光(IFA)分析,结果表明,HA蛋白在sf9昆虫细胞中正确表达,分子质量约为45 ku,并具有良好的反应原性。为进一步研制H5N1亚单位疫苗的研发及研制H5亚型ELISA抗体试剂盒奠定了基础。