新复苏MDCK细胞培养甲型H3N2流感病毒方法的优化

目的优化甲型H3N2流感病毒在新复苏的犬肾细胞(MDCK)上的培养条件,提高该病毒在新复苏细胞上培养的分离效果。方法选取6例复核鉴定过的甲型H3N2病毒株,以吸附法分别接种于新复苏的MDCK细胞上培养,检测收获病毒液HA滴度,通过比较不同的细胞胞龄、细胞代次、病毒接种吸附时间对甲型H3N2流感病毒易感性的影响,确定最佳培养条件。结果不同胞龄MDCK细胞接种H3N2病毒后,胞龄为3 d、4 d的细胞所收获的病毒液HA滴度均明显高于其他组,差异有统计学意义(F=1. 279,P=0. 027);对复苏后第2代、第3代、第4代细胞进行接种后,H3N2病毒HA均明显高于第一代细胞,差异有统计学意义(F=0. 765,P=0. 008);病毒接种吸附时间(1～2 h)对甲型H3N2病毒HA滴度没有明显影响,差异无统计学意义(F=2. 743,P=0. 178)。结论甲型H3N2病毒接种于新复苏MDCK细胞最佳培养条件为:选用复苏后传代培养至第二代及以后、胞龄3～4 d的MDCK细胞进行接种,接种吸附时间1～2 h之内,可获得HA滴度较高的甲型H3N2流感病毒液。

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)、胰酶终浓度(2.5、5、7.5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10^4、100×10^4、300×10^4、500×10^4、700×10^4个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10^-2、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10^4个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖的HA血凝滴度及病毒滴度(CCID50)均明显高于贴壁培养的MDCK细胞(P<0.05)。结论优化了乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件,为后续采用生物反应器大规模生产流感疫苗奠定了基础。