临床细菌与H3N2流感病毒共感染特征及病毒血凝素裂解位点的变异研究

目的了解流感样病例中临床细菌与H3N2流感病毒共感染及病毒血凝素(HA)裂解位点的变异特征。方法收集2013年1月至2018年12月的流感样病例样本12250份,实时荧光PCR检测H3N2流感病毒。选取部分流感阳性病例样本,采用实时荧光PCR的方法进行金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和B型流感嗜血杆菌的检测,分析其临床感染特征。分离流感病毒,RT-PCR扩增病毒HA,测序,构建进化树,并分析裂解位点氨基酸变异特征。结果2013年以来,每年都有H3N2流感病毒的流行,H3N2在流感阳性病例中的占比为44.69%。随机选取2013—2018年间流感流行高峰的H3N2阳性病例样本295份,29.2%的病例存在临床细菌感染。对分离到的210株H3N2流感病毒进行HA裂解位点测序,68株存在变异,其中63株为K342R单氨基酸位点变异,裂解位点由PEKQTR转变为PERQTR。裂解位点未变异样本的细菌共感染率为31.25%(45/144),裂解位点变异样本的细菌感染率为23.53%(16/68),二者的差异没有统计学意义(χ2=1.34,P>0.05)。杭州地区流行的H3N2流感病毒主要属于3C.3a和3C.2a两个进化簇,裂解位点发生K342R变异的病毒属于3C.3a进化簇。结论H3N2流感病毒在杭州地区的流感病毒流行中占据重要地位。流感阳性病例存在着一定程度的细菌共感染。裂解位点变异具有一定的地域流行特征,但与细菌共感染没有显著相关性。

鸭源H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建

H5N1亚型clade 2.3.4为我国南方地区的优势毒株。A/mallard/Huadong/S/2005(S)病毒在遗传进化上属于clade 2.3.4,而A/mallard/Huadong/Y/2003(Y)病毒属于clade 2。通过删除S病毒和Y病毒的HA多碱性氨基酸序列,S病毒由PLRERRRKRGL改变为PLREGRGL,Y病毒由PQR-ERRKKRGL改变为PQREGRGL,使之成为低致病性特征的HA基因。将S病毒和Y病毒的NA基因和突变的HA基因分别组合,由A/Puerto Rico/8/34(PR8)病毒提供6个内部基因,进行拯救,共获得4个致弱病毒(SS,SY,YS,YY)。这4个致弱病毒对SPF鸡的静脉内致病指数(IVPI)为0,对10日龄SPF鸡胚无致病性。SS、SY、YS、YY病毒第10代鸡胚尿囊液的HA效价分别为9、11、111、1 lb。

H5和H7亚型高致病性禽流感病毒新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法除对H5和H7亚型HPAIV检测结果为阳性外,对其它几种常见的禽病病原检测结果均为阴性,该方法特异性强;敏感性试验结果显示,该方法检测下限为病毒浓度1×101TCID50/mL,而常规荧光定量RT-PCR检测下限为1×102TCID50/mL,敏感性高;标准曲线分析后结果显示,本研究所建立方法的扩增效率比常规荧光定量RT-PCR高,二者相关系数均为0.997;批内和批间重复性试验结果显示,Ct值的变异系数均小于2%以下,重复性高。临床样品检测结果显示,该方法所需样本微量仅为1μL^2μL;操作简便、快速,检测过程<40 min,可用于现场检测;而且利用该方法与常规荧光定量PCR方法以及测序对临床样品进行检测,三者结果完全吻合。本研究所建立的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR检测方法为H5和H7亚型HPAIV监测和临床检测提供了可行的技术手段。