HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因真核重组载体的构建和鉴定

目的：构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒（HBV）HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。方法：采用PCR法扩增HBcAg基因，并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个NheⅠ酶切位点，然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoRⅠ和BamHⅠ之间。同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因，并在其两端分别引入NheⅠ酶切位点，通过酶切、连接，将这段基因插入到HBcAg基因的NheⅠ酶切位点上。将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示，插入片段大小均与预计相符。测序结果与已知序列结果一致。结论：成功构建了HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。

HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒的构建

目的:构建HBV核心蛋白与人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)融合蛋白HBV载体质粒。方法:构建表达HBV核心蛋白的乙肝病毒载体质粒PdssX;以质粒PC-A3C为模板扩增A3C,将扩增的A3C及PdssX分别用Aor13H Ⅰ和BSE Ⅱ酶切双酶切,以T4连接酶连接转化TOP10感受态细胞,然后PCR和双酶切鉴定及测序鉴定。结果:酶切所获载体片段和目的基因片段的大小均与预期的相一致,经测序证实为pCH-CoreA3c基因,表明CoreA3c基因HBV载体质粒pCH-CoreA3c构建成功。结论:成功构建HBV核心蛋白与A3C融合蛋白HBV载体质粒pCH-CoreA3c,为下一步CoreA3c融合蛋白的原核表达及其抗病毒作用研究奠定了基础。

花生NADH脱氢酶1亚基10B-like基因克隆表达分析及载体构建

NADH脱氢酶是线粒体氧化呼吸链上重要的复合物,对线粒体功能有至关重要的作用。本研究以花生品种"日花1号"为材料,利用RACE方法成功得到NADH脱氢酶1亚基10B-like基因(ND1-10B-like)的c DNA和DNA全长。基因开放阅读框为321 bp,编码106个氨基酸组成的肽链,预测的蛋白质分子量为12 570.29 Da,等电点为6.97。DNA序列包含一个内含子和两个外显子,共1 269 bp。检测了基因组织表达和胁迫表达情况,结果显示该基因在叶片中表达量最高,在青枯菌胁迫条件下0.5 h表达量即可升高到初始值的5.7倍,对生物胁迫反应非常迅速。并进一步构建了基因过表达载体p CAMBIA2300-OE-ND1和反义表达载体p CAMBIA2300-IN-ND1,并为进一步研究花生中该基因的功能及其在花生抗青枯病中的作用提供帮助。

大豆fad3c基因沉默载体的构建

构建大豆fad3c基因的沉默载体,旨在为培育生物安全的高油酸低亚麻酸转基因大豆奠定基础。从高蛋白大豆黑农35中克隆大豆种子特异表达启动子GY1;从高油大豆黑农37中克隆fad2-1b基因内含子1;从5个转基因受体大豆中克隆fad3c基因片段,作为正向臂和反向臂。构建筛选标记基因为bar,启动子为GY1,内含子为fad2-1b基因内含子1的双T-DNA载体。将双T-DNA载体转化大肠杆菌DH5α,酶切和序列分析鉴定表明扩增得到的重组质粒正确,命名为pDT-GFAD3I。

组蛋白变异体macroH2A1真核表达载体构建及其细胞内定位的研究

目的构建带有血凝素(HA)标签的小鼠组蛋白变异体macroH2A1(mH2A1)的真核表达载体,并观察其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况。方法提取内毒素休克的BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过逆转录-聚合酶链反应获得内毒素休克小鼠肝脏组织的cDNA,以cDNA为模板使用PCR方法扩增得到mH2A1编码序列,并将其酶切后连接至带有HA标记的载体pcDNA3-HA上;对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。随后将重组质粒瞬时转染293T细胞,利用荧光显微镜观察。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明pcDNA3-mH2A1-HA真核表达质粒构建正确;经转染实验发现,该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核中。结论 mH2A1真核表达载体pcDNA3-mH2A1-HA的成功构建及明确其在哺乳动物细胞中的具体核定位,为进一步研究mH2A1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。