P4HA2通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的增殖

目的:探讨P4HA2在食管鳞癌中的表达情况及作用机制。方法:利用基因表达综合数据库(GEO)的RNA表达谱数据及免疫组织化学染色和Western blot技术分析食管鳞癌组织及正常食管组织中P4HA2的mRNA和蛋白表达情况;通过细胞增殖实验、集落形成实验和裸鼠移植瘤实验,在体外和体内检测P4HA2对食管鳞癌细胞恶性表型的影响;利用Western blot检测P4HA2调控的下游通路及关键分子。结果:与正常食管组织相比,食管鳞癌组织中P4HA2的mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.01);体外和体内实验结果显示,与对照组相比,敲降P4HA2可显著抑制食管鳞癌细胞的增殖、集落形成以及裸鼠移植瘤的生长(P<0.01);分子水平检测表明,敲降P4HA2显著降低EGFR的蛋白水平,以及AKT和S6的磷酸化水平(P<0.05);在食管鳞癌细胞中敲降P4HA2后回复EGFR的表达,AKT和S6的磷酸化水平以及细胞增殖和集落形成表型均得以恢复(P<0.01)。结论:P4HA2在食管鳞癌组织中高表达,且P4HA2通过激活EGFR/AKT/S6信号通路促进食管鳞癌细胞的增殖和肿瘤生长。

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。

重组DKK1及pCMV-HA2/DKK1重组质粒对宫颈癌细胞体外增殖作用的影响

目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,western blot及ELISA法检测转染pCMV-HA2/DKK1重组质粒后Hela细胞中DKK1蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10,50 ng/mL的DKK1对Hela细胞有明显抑制作用(F分别为162.31,184.65,P均<0.01);抗DKK1抗体对Hela细胞的增殖影响无统计学意义(P均>0.05);pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后对细胞增殖有明显抑制作用,加入抗DKK1抗体不能完全拮抗pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞的抑制作用;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后可检测到DKK1蛋白表达,经western blot证实为DKK1蛋白(Mr约为38 000),ELISA法结果表明,DKK1蛋白的分泌量随培养时间的延长而增加,第5天时达峰值(19.82 mg/L)。结论重组DKK1和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1可抑制Hela细胞的增殖,抗DKK1抗体可部分抵抗DKK1的抑制作用,提示DKK1在宫颈癌肿瘤发生中对肿瘤细胞具有抑制作用。

牙龈卟啉单胞菌HA2基因与牙周病关系的研究

目的利用PCR及RT-PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P·g)HA2的DNA和RNA水平,探讨其分布规律及与牙周病的关系。方法12例慢性牙周炎患者共采集36个龈下菌斑标本,记录临床指标(探诊深度、临床附着水平、牙龈指数、菌斑指数、龈沟出血指数),PCR及RT-PCR扩增龈下菌斑标本中的P·g HA2基因,扩增产物经琼脂糖电泳、拍照,应用计算机软件GeneTools扫描并计量其中的相对核酸含量。结果P·g HA2在DNA水平上的检出率为92%,在RNA水平上的检出率为86%。P·g HA2的DNA水平与探诊深度及牙龈指数之间存在正相关关系(P<0·01);P·g HA2的RNA水平与牙龈指数之间存在正相关关系(P<0·05)。结论P·g HA2基因广泛存在于慢性牙周炎患者的龈下菌斑中,且P·g HA2在DNA和RNA水平上与牙周状态关系密切,提示P·g HA2可能是P·g致病因子之一。

NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定

目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,收集病毒上清,Dot blot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞存活率的影响。结果:经酶切及测序证实克隆出NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因;得到高滴度的(3.14×1015pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用,与对照组比较,处理组细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-Ap-optin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。

调控miR-495、P4HA2的表达对肝纤维化和肝细胞癌发生机制研究

目的:探究调控miR-495、脯氨酰4-羟化酶亚基α-1(P4HA2)的表达对肝纤维化、肝细胞癌的发生机制。方法:体外构建P4HA2的3’UTR报告基因质粒,使用荧光素酶报告基因检测miR-495与P4HA2的调控关系。使用miR-495及其反义链处理HepG2肝细胞癌细胞检测P4HA2的表达。低氧条件下检测HepG2肝细胞癌细胞中miR-495和P4HA2的表达,以及细胞增殖反应。在28例肝细胞癌患者中检测miR-495和P4HA2的表达,分析其相关性。结果:萤光素酶报告基因检测显示miR-495显著抑制了HepG2细胞中pGL3-P4HA2-wt的荧光素酶活性,但不能抑制pGL3-P4HA2-mut的荧光素酶活性。miR-495的过表达能够在HepG2细胞中以剂量依赖性方式抑制P4HA2的mRNA和蛋白表达。低氧组HepG2细胞中miR-495的表达显著低于正常组,而P4HA2的表达显著高于正常组。增殖检测表明低氧组HepG2细胞中EdU阳性细胞数显著增加,而在低氧组细胞中过表达miR-495可以明显逆转HepG2细胞的增殖。肝细胞癌中miR-495与P4HA2的mRNA的水平呈负相关(r=-0.683,P<0.05)。结论:miR-495能够通过靶向P4HA2 mRNA的3’UTR来抑制肝细胞癌细胞的增殖,而低氧可以通过下调miR-495来促进P4HA2的表达,进而参与肝纤维化和肝细胞癌的发生发展。

H3N2亚型猪流感病毒HA1、HA2基因的原核表达及抗原性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的一个重要蛋白,在疾病预防和治疗中具有重要作用。本试验旨在克隆和表达H3N2亚型猪流感病毒A/swine/Henan/1/2010(H3N2)的HA1和HA2基因。用含有H3N2亚型SIV的鸡胚尿囊液提取RNA,RT-PCR扩增后将目的基因定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体上,并将其转入宿主菌BL21(DE3)pLyS进行表达,IPTG诱导后经SDS-PAGE检测并用该病毒重组HA蛋白制备的特异性单克隆抗体1C10作为一抗对两种蛋白进行Western blotting分析。SDS-PAGE结果显示,得到HA1和HA2大小分别为34.8、23.2ku的重组蛋白,Western blotting结果表明,HA1蛋白与1C10单克隆抗体具有良好的反应原性,且1C10单克隆抗体表位在HA1蛋白上。本试验结果为进一步研究血凝素蛋白的结构和功能,以及建立快速诊断方法和基因工程疫苗提供材料。

以HA2为基础的流感病毒候选疫苗同时与H5N1、H1N1和H3N2亚型毒株产生交叉反应

【目的】探讨以流感病毒(IAV)血凝素蛋白茎部(HA2)保守表位为免疫原来诱导针对不同血清型流感病毒的广谱体液免疫应答。【方法】我们构建了一个重组的IAV疫苗IR30-Fd,由A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)病毒株HA2的30个保守的氨基酸残基(IR30)和一个连在碳端的三聚体基序(foldon,Fd)组成。原核表达该蛋白,圆二色谱和Western Blot验证IR-30-Fd的室间结构之后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,并同时免疫IR30多肽为对照,制备血清抗体。然后应用ELISA和Western Blot方法检测抗体的滴度,应用细胞ELISA和Western Blot方法检测抗体与不同的IAV菌株HA2蛋白的交叉反应性。【结果】IR30-Fd能够形成具有α螺旋的三聚体空间结构。用IR30-Fd和IR30免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔后获得了高效价的抗IR30的特异性抗体。鼠抗IR30-Fd抗体能与H3N2和H1N1的HA蛋白反应而鼠抗IR30抗体不能。鼠抗IR30-Fd抗体稀释6 400倍、兔抗IR30-Fd抗体稀释8.2×105倍均可以与H5N1的HA蛋白反应。细胞ELISA表明兔抗IR30-Fd抗体与天然状态下的H5N1和H3N2的HA蛋白的结合亲和力高于兔抗IR30抗体。【结论】本研究结果表明IR30-Fd蛋白能够模拟H5N1 HA2蛋白保守序列的天然三聚体结构,并且能够诱导产生针对H5N1 H1N1和H3N2亚型HA蛋白的广谱交叉反应抗体,为研制通用的流感病毒疫苗提供了结构基础。

土家族高度近视患者P4HA2基因突变筛查

目的探索P4HA2基因在土家族高度近视人群中的突变情况。方法收集2015年6月至2017年6月土家族双眼屈光度≥6.0 DS且眼轴长度≥26 mm的高度近视患者288例,对患者行眼科相关检查并采集外周静脉血5 ml,用酚氯仿法抽提患者外周血DNA。通过Sanger测序筛查P4HA2基因可能的致病突变。对于发现的可疑致病突变,均在同地区192例正常人群中进行验证,并通过生物信息学分析预测基因突变的致病性。结果本研究在288例土家族高度近视患者中共发现4个P4HA2基因突变,包括1个错义突变(c.145C>A)、2个内含子突变(c.1306-62C>T、c.82+22C>T)和1个插入突变(c.179+16_179+17 ins T),其中2个内含子突变及1个插入突变通过在线预测不致病,而错义突变c.145C>A通过Polyphen2在线预测为可疑致病,参照美国ACMG的标准,此变异致病性不确定。结论P4HA2基因错义突变c.145C>A为土家族高度近视患者可疑致病基因突变。

M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒流感疫苗的构建及血清学检测

目的构建M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒通用流感疫苗,并进行免疫血清学检测。方法将流感病毒M2e和HA2抗原表位与Ferritin蛋白串联表达,非变性条件下提取并经亲和层析纯化获得纳米自组装颗粒,经Western blot和电镜验证后免疫小鼠。2次免疫后采集小鼠血清,使用Western blot进行抗原性检测,使用ELISA进行抗体水平检测。结果成功制备M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒,将其免疫小鼠后血清中产生高水平的M2e和HA2特异性抗体。结论M2e-HA2串联表位的自组装纳米颗粒可以刺激小鼠产生高水平的M2e和HA2特异性抗体,为通用流感疫苗研发奠定基础。

H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达与免疫原性初步研究

目的利用真核表达载体构建H7N9禽流感病毒血凝素刺突茎部(HA2)的真核表达质粒,在293F细胞中表达HA2蛋白,并初步探讨其免疫原性。方法根据pMD18-T-HA中的序列设计H7N9禽流感病毒HA2扩增引物,在下游引物中引入胰酶酶切位点;目的基因经特异性酶切位点克隆入自身带有Fc标签的pFUSE-IgG1-Fc1载体,构建重组质粒HA2-Fc;将重组质粒转染293F细胞,通过间接免疫荧荧光(IFA)和免疫印迹法(WB)鉴定HA2蛋白的表达和免疫原性。结果成功构建H7N9禽流感病毒HA2基因真核表达质粒HA2-Fc,并在293F细胞中表达出分子量大约为50kDa的重组蛋白。IFA和WB显示该蛋白与抗H7N9病毒鼠多抗具有良好的免疫反应。结论成功构建表达HA2亚单位的真核表达系统,重组蛋白具有较高的免疫原性,为筛选H7N9广谱疫苗候选分子、广谱中和抗体,及深入研究其致病机理和免疫机制奠定基础。

牙龈卟啉单胞菌血凝集素黏附结构域ha2基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的在原核表达质粒pET21a-ha2成功构建的基础上,诱导目的基因在大肠杆菌中表达,进行表达产物的纯化及鉴定。方法原核表达质粒pET21a-ha2经PCR鉴定后,转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞诱导筛选,经SDS-PAGE电泳检测,IPTG诱导表达。通过包涵体的变复性、Millipore超滤系统的滤浓缩、Ni-TA层析分离纯化HA2蛋白。结果原核表达质粒pET21a-ha2转化大肠杆菌经IPTG诱导后,成功表达HA2蛋白,大小约15 kD,与预计目的蛋白大小相同。HA2纯化蛋白浓度为0.449 mg/mL,经测序与NCBI蛋白数据库比对无突变。结论pET21a-ha2可在大肠杆菌中成功表达,并成功得到纯化的HA2蛋白。

表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型沙门菌DNA疫苗载体的构建

为了构建表达禽流感病毒H9N2亚型血凝素HA2蛋白的延迟裂解型沙门氏菌载体,本试验首先将绿色荧光片段EGFP插入到真核表达载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-EGFP,并转染巨噬细胞系RAW264.7,共聚焦显微镜下观察其表达情况;再通过PCR技术扩增HA2基因,将其克隆到沙门菌载体p YA4545中,构建重组质粒p YA4545-HA2,继而转染HEK-293T细胞,收集细胞总蛋白,通过Western-blot检测HA2蛋白的表达情况;最后将重组质粒电转到沙门菌宿主χ11218中,检测重组菌对阿拉伯糖的依赖性。结果,p YA4545真核表达体系能够有效表达;重组质粒p YA4545-HA2的HA2蛋白成功表达;重组菌对阿拉伯糖具有明显依赖性。本试验成功获得了以延迟裂解型沙门氏菌为载体表达禽流感病毒HA2蛋白的菌株,为后续开发以HA2为目标抗原的新型口服疫苗奠定了基础。

H9N2亚型禽流感病毒M2e和HA2串联蛋白在原核系统中的表达

构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区（M2e）和HA蛋白颈部区（HA2）串联体，并在原核系统中进行该重组蛋白的表达，以便研究重组蛋白的反应原性。以含有全长H9N2亚型AIVHA基因的质粒为模板，经过PCR扩增得到HA2基因；利用BglⅡ和BamHⅠ互为同尾酶的链接方法，构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体，并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e＋HA2-pGEX重组质粒；同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX；DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后，转化至表达宿主菌中；重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导；SDS—PAGE电泳鉴定重组蛋白大小，并进行可溶性分析和纯化；采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示，3M2e＋HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0．5mmol／L和0．25mmol／L的IPTG诱导，37℃培养4h时，表达量最高；3M2e＋HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59．4ku和49．8ku；对重组蛋白进行可溶性分析显示，两种重组蛋白均以包涵体形式存在；Western blotting分析显示，3M2e＋HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应，这些结果为进一步研究HA2、3M2e＋HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据。

表面展示H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的新功能型乳酸菌的构建

为了构建HA2基因的新功能型重组乳酸菌,本试验通过PCR将来源于H9N2亚型禽流感病毒的血凝素基因HA2插入锚定表达载体p SIP409-pgsA’中,构建重组质粒pSIP409-pgsA’-HA2,并将其电转到植物乳杆菌NC8中,通过W estern-blot检测目的蛋白的表达情况。结果显示,成功构建了NC8-pSIP409-pgsA’-HA2,经Western-blot检测目的蛋白被成功表达,并且具有反应原性,目的条带大小与目的蛋白一致,为后期试验奠定了基础。

表达禽流感病毒HA2-DEC205的减毒沙门菌DNA疫苗载体的构建与初步研究

构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型重组减毒沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-sec)和χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec),将其免疫小鼠,通过流式细胞术检测免疫细胞的变化。结果表明,沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec)能够提高CD3+CD4+T细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。这说明重组沙门菌免疫小鼠能够激活机体的免疫系统,诱导发生一定的免疫反应。

HA/H_(2)O_(2)体系对磺胺噻唑降解的机理与效能

以盐酸羟胺/过氧化氢(HA/H_(2)O_(2))作为研究体系,考察其对于磺胺噻唑(STZ)的降解效能。文章考察了HA初始浓度、H_(2)O_(2)初始浓度、STZ初始浓度、pH、天然有机物(NOM)、阴离子(SO_(4)^(2-)、Cl-和NO_(3)^(-))对STZ降解的影响。结果表明:在pH值=3.0的条件下,HA/H_(2)O_(2)体系对STZ具有高效的降解效果,当HA的物质的量浓度由2 mmol/L增加到10 mmol/L时,对STZ的去除率从56.06%增加到85.26%;当H_(2)O_(2)的物质的量浓度从2 mmol/L增加到10 mmol/L时,对STZ的去除率从58.96%增加到85.26%,当STZ的物质的量浓度从2μmol/L增加到10μmol/L时,对STZ的去除率从98.72%降低到71.86%。随着pH的增大,STZ的去除率逐渐降低,在pH值>7的条件下对STZ的去除率可以忽略不计。向反应体系中分别投加5 mmol/L的SO_(4)^(2-)和5 mmol/L的NO_(3)^(-)都可以有效促进STZ的降解,而5 mmol/L的Cl^(-)则会抑制STZ的降解。当向体系中投加小于5 mg/L的NOM则对STZ的降解的影响可以忽略不计。测定了体系中共有17种降解产物,并推测STZ通过取代反应、羟基化反应等方式逐步被降解。通过明亮发光杆菌发光值变化分析降解过程中溶液毒性的变化,测定发现STZ降解过程中急性毒性不高。实际水体试验结果表明,HA/H_(2)O_(2)系统对二级出水中的荧光类物质具有较好的降解效果。

P4HA2在促进肿瘤进展中的作用

P4HA2是编码胶原蛋白脯氨酰4-羟化酶(C-P4H)的α亚基的重要基因之一,在多种肿瘤中过表达并促进肿瘤进展,其高表达与患者的不良预后相关。在不同肿瘤中,P4HA2可以促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,增加肿瘤干细胞群体的比例,以及促进肿瘤细胞免疫逃逸等。深入了解P4HA2在肿瘤进展中的作用,可为针对P4HA2预防或逆转肿瘤进展提供新的思路和见解。

黄芩苷抑制H5N1禽流感病毒进入的机制研究

研究黄芩苷抑制H5N1禽流感假病毒的活性及其作用机理。采用H5N1假病毒检测体系,观察黄芩苷对不同H5N1禽流感假病毒株进入的抑制作用;并结合VSVG假病毒为阴性对照,判定黄芩苷是特异性的作用于H5N1禽流感病毒的进入环节;采用血凝抑制实验、ELISA实验分析其作用机理,采用MTT法测定黄芩苷毒性。黄芩苷能特异性的抑制A/Anhui/1/2005,A/Xinjiang/1/2006,A/Hong Kong/156/1997,A/Qinghai/59/2005,A/Thailand/Kan353/2004,A/Viet Nam/1194/2004 H5N1禽流感假病毒株的进入,IC50分别为65.76±5.61μM、54.98±4.38μM、46.81±5.12μM、32.88±4.18μM、63.30±1.59μM、43.23±3.43μM;黄芩苷对血凝素HA2亚基有抑制作用,IC50为35.86±3.09μM。黄芩苷在体外具有抑制H5N1禽流感进入的作用,其作用机制为抑制血凝素HA2亚基。

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。