共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响

通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。

共表达HAC1和分子伴侣基因对甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响

为了提高甘露聚糖酶ManA在毕赤酵母中分泌表达的酶活,选择毕赤酵母内质网未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)激活调控因子HAC1与5种毕赤酵母蛋白折叠相关的分子伴侣ERO1、PDI、PDI1、CPR5、BiP,通过构建pPICZA-HAC1等6种胞内表达重组质粒,分别电转化至分泌表达ManA的毕赤酵母重组菌中胞内共表达,并分析其重组菌摇瓶发酵时ManA表达的影响。结果发现在摇瓶发酵水平,胞内共表达HAC1、ERO1、PDI的重组菌发酵上清液中的ManA酶活力分别提高了26%、15%、20%,其重组菌发酵上清液的酶活力分别达到1 014 U/mL、925 U/mL、965 U/mL。通过对各重组菌上清液酶活力、胞内滞留酶活力、上清液蛋白浓度数据进行分析,进一步选择将HAC1、ERO1、PDI进行两基因或三基因组合,并分别在分泌表达ManA的重组菌胞内共表达,但各共表达重组菌发酵上清液的酶活力都没有进一步的提升。单独共表达HAC1或者分子伴侣ERO1、PDI可以辅助ManA的正确折叠,提高其蛋白表达。

HAC1基因过表达对重组人CTLA-4蛋白在毕赤酵母中分泌表达的影响

重组人细胞毒性T细胞相关抗原(Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4,CTLA-4)是一类重要的基因工程药物,其在毕赤酵母中表达水平偏低使其一直无法广泛应用于临床治疗.而影响毕赤酵母中的外源蛋白分泌表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力.本文通过在毕赤酵母细胞中过表达HAC1基因对毕赤酵母细胞中未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)的信号通路进行调控,从而改善了CTLA-4蛋白的表达水平.摇瓶中改造菌株M-HAC1发酵上清液中该蛋白的分泌表达量是原始菌株表达量的2.55倍.

共表达PDI1、MDH1和HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡糖氧化酶的影响

葡糖氧化酶(GOD)可催化葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸,在工业上被广泛应用。在构建的一株整合多拷贝GOD基因且含有HAC1表达单元的重组毕赤酵母G/GMH1的基础上,共表达分子伴侣二硫键异构酶基因PDI1和苹果酸脱氢酶基因MDH1,考察PDI1、MDH1基因与HAC1共表达后对GOD分泌表达的影响。这些基因共表达后对重组菌的生长无明显影响。PDI1和MDH1分别与HAC1共表达后,重组菌G/GMH1-PDI1和G/GMH1-MDH1的胞外GOD产量达到11731.9U/g DCW和11047.6U/g DCW,比出发菌提高了17.3%和10.4%,前者达到了目前所报道摇瓶培养的最高单位菌体酶活水平。而三基因共表达重组菌G/GMH1-PDI1-MDH1的GOD产量略有下降。在所构建的菌株中,GOD基因的转录水平仅在G/GMH1-PDI1-MDH1中略有提高,与酶产量的提高无直接关系。与出发菌相比,共表达基因的转录水平在新构建的菌中有不同程度的升高,说明这些基因被成功转录。PDI1和MDH1基因转录在G/GMH1-PDI1和G/GMH1-MDH1中分别被上调,可能与GOD产量提高有关。虽然GOD、HAC1、PDI1和MDH1基因在G/GMH1-PDI1-MDH1中均被上调,但并未促进酶产量的提高。