中国美利奴羊DLX3基因3′UTR的多态性及其与羊毛品质性状的关联分析

为探讨DLX3基因的多态性与绵羊羊毛品质及生长性状的关系,本研究以5个品系的中国美利奴羊(新疆军垦型)为试验材料,采用PCR-RFLP方法开展了DLX3基因3′UTR区4个SNPs的多态性检测。通过卡方检验分析了4个SNPs在各品系绵羊中的等位基因频率,采用连锁不平衡分析构建了这4个SNPs的单倍型,最后将单位点和单倍型分别与绵羊羊毛品质和生长性状进行关联分析。结果表明:4个SNPs在5个品系间的等位基因频率均存在极显著差异(P<0.01);超细毛绵羊品系与其他4个品系间的基因型分布均存在极显著差异(P<0.01),2个多胎品系与其他3个品系间的基因型分布同样存在极显著差异(P<0.01);相关分析显示,这4个SNPs及其单倍型均对羊毛卷曲度有显著影响(P<0.05),而对其他羊毛性状及生长性状无显著影响(P>0.05)。由此可见,中国美利奴羊(新疆军垦型)DLX3基因3′UTR区的多态性与绵羊毛发卷曲度性状显著相关,可以尝试使用这些SNPs开展高品质细毛羊的分子标记辅助选择。

草原红牛胰岛素样生长因子Ⅰ受体基因3′UTR序列多态性分析

以58头草原红牛为试验材料,采用PCR-SSCP技术对胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因3′UTR序列多态性进行了检测。结果表明,在IGF-ⅠR基因3′UTR中发现PCR-SSCP的多态位点,有2种等位基因和3种基因型。对所得基因型与生长和胴体性状的相关性分析结果发现,在3′UTR中AB型的胴体产肉率、肉骨比显著高于AA、BB型(P<0.05);AA型的脂肪覆盖率显著高于BB型(P<0.05),与AB型差异不显著(P>0.05)。

鼻咽癌表达下调基因NASG3'UTR可变剪接分析及其在多种肿瘤中的表达

背景与目的:采用抑制性消减杂交技术已分离获得了人鼻咽组织特异性基因NASG。本研究对人鼻咽组织特异性表达且在鼻咽癌表达下调的NASG基因3'非编码区(untranslatedregion,UTR)的可变剪接进行分析,并考察NASG基因在多种肿瘤组织中的表达。方法:在NASG基因3'UTR存在可变剪接部位的两端设计引物进行RT-PCR扩增,分离扩增产物并测序。用RT-PCR检测NASG基因在鼻咽癌中的表达,采用了肿瘤表达谱阵列(cancerprofilingarray)杂交分析NASG基因在多种肿瘤组织的表达状况。结果:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因在71%的鼻咽癌活检组织中表达下调,25%的肺癌组织中表达上调,而在其他肿瘤及其配对的正常组织未见明显表达。结论:NASG基因3'UTR存在3种剪接产物,NASG基因的表达异常是鼻咽癌和肺癌发生、发展过程中重要的分子事件。

猪蛋白编码基因3’UTR中IRPRE1元件的鉴定及其基因特征分析

为鉴定猪全基因组范围内蛋白编码基因3’UTR(3’-untranslated region)中反向重复PRE1(inverted repeated PRE1,IRPRE1)元件,对猪全基因组的22342个蛋白编码基因的3’UTR序列进行重复序列元件的生物信息学分析。结果表明:猪蛋白编码基因的3’UTR序列中短散在重复序列与简单重复序列在重复序列的类别中所占比例较高,分别为27.58%与31.08%;在SINE/t RNA的重复元件中,Pre0_SS和PRE1x元件所占的比例较高,分别为41.83%和37.51%;共有1 094个候选蛋白编码基因的3’UTR中含有IRPRE1元件;GO分析发现这些候选基因主要参与m RNA经由剪接体的剪接、细胞分裂、RNA通过酯交换反应发生的剪接、T细胞激活、RNA剪接、T细胞受体信号通路、对糖苷反应、甘油三酯稳态、外源性凋亡信号通路的正调节及胆固醇合成等生物过程;KEGG pathway分析发现这些候选基因参与了缬草碱、亮氨酸和异亮氨酸降解途径、TNF信号通路、T细胞受体信号通路、RIG-I样受体信号通路、吞噬体、剪接体、胆汁分泌、甲状腺激素合成和凋亡;对3个蛋白编码基因的3’UTR中的IRPRE1元件进行鉴定发现,其在多个组织中广泛表达。

β珠蛋白基因3′UTR+101G>C(HBB:c.*233G>C)变异的遗传学效应分析

目的:探讨β珠蛋白基因3′UTR+101G>C(HBB:c.*233G>C)变异是否具有遗传学效应,为地中海贫血的基因诊断和遗传咨询提供依据。方法:应用全血细胞分析和毛细管电泳进行血液学指标分析,采用PCR-流式荧光杂交法检测中国南方人群常见的23种地中海贫血相关突变,采用一代测序方法检测β珠蛋白基因(HBB)的其他变异位点。结果:在463个进行HBB基因测序的病例中共检测到7个病例携带HBB:c.*233G>C变异,其中4例同时携带HBB基因其他致病性变异(2例反式排列,2例顺式排列),均为典型的轻型β地中海贫血的血液学特征,3例同时携带异常血红蛋白变异,均不具有β地中海贫血的血液学特征。结论:本研究的数据显示HBB:c.*233G>C变异无明显遗传学效应,应为多态性位点。

肉牛CAST基因5'UTR和3'UTR多态性分析

钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin,CAST)专一抑制钙蛋白酶(Calpain,CAPN)活性,参与调节牛肉的嫩化及肌内蛋白的水解,其编码基因是肉质性状的主要候选基因。本研究根据牛CAST基因5'UTR区(GenBank No.AY834771)和3'UTR区(Gen Bank No.DQ991097)序列设计两对引物,用PCR-SSCP方法对鲁西黄牛和渤海黑牛共305个样本进行了单核苷酸多态性分析。结果显示,CAST基因5'UTR和3'UTR区存在PCR-SSCP多态,在5'UTR区存在6437(C/T)、6477(G/A)和6614(G/T)3个SNP位点,表现为AA、AB、BB、BC和AD 5种基因型;在3'UTR区存在359(T/C)和366(A/G)2个SNP位点,表现为EE、EF、FF和EG 4种基因型。经检验表明,鲁西黄牛和渤海黑牛均处于非Hardy-Weinberg平衡状态;群体遗传多态性分析表明这两种牛的多态信息含量均为中度多态。

猪ERK6基因3′UTR的克隆及序列分析

为了给猪ERK6基因的功能研究提供信息资料,试验以已报道的猪ERK6基因CDS序列为模板设计引物,利用RACE技术扩增了猪ERK6基因3′UTR序列,并采用DNAMAN、DNASTAR及CLUSTALW2软件分析序列特征。结果表明:分离的产物共827bp,包含部分编码区281bp、3′UTR序列439bp、poly(A)60、接头引物47bp,将前三部分序列共780bp上传至GenBank,登录号为NM_001025224;此序列poly(A)60位点上游14个核苷酸处有CPSF结合位点,与人、鼠3′UTR序列的相似性为41%、48%。说明分离获得的片段为猪ERK6基因的3′UTR序列。

心脏圆锥动脉干畸形患儿TBX1C基因3'UTR区域突变分析

目的筛查心脏圆锥动脉干畸形(CTHD)患者中TBX1C基因3'UTR区域存在的基因突变,探讨该区域突变影响TBX1C基因表达的可能机制。方法选取无22q11.2区微缺失的52例CTHD患儿(CTHD组)和89名健康儿童(对照组)作为研究对象,PCR扩增TBX1C基因完整3'UTR区序列,所有扩增片段均进行双向测序;将测序结果与GenBank中TBX1C 3'UTR序列(NM 080647.1)进行比对,筛查出可能存在的基因突变;PicTar和TargetScan在线预测软件预测可能与TBX1C基因3'UTR区结合的微RNA(miRNA),分析TBX1C基因3'UTR区突变对miRNA调控TBX1C基因表达的影响。结果在CTHD组中发现1例突变c.*164_*165insC,即在距离终止密码子164位与165位核苷酸之间插入1个胞嘧啶;该突变在对照组中不存在,其他研究中未见报道,为新发突变;预测结果显示10种miRNA能与TBX1C基因3'UTR区结合,该突变并不位于10种miRNA与TBX1C3'UTR的结合区域。结论 TBX1C基因3'UTR区域存在新发突变c.*164_*165insC,该突变可能改变TBX1C3'UTR区域与miRNA结合的空间构象,进而影响miRNA对TBX1C基因表达的调控作用。

食源性肥胖小鼠IRX3基因5′UTR区甲基化率研究

为了研究食源性肥胖小鼠腹部脂肪组织中IRX3基因5′UTR区甲基化情况及IRX3基因mRNA表达情况,将雄性C57BL/6J小鼠进行食源性肥胖造模,采用RT-qPCR法检测IRX3 mRNA表达情况,BSP(Bisulfite sequencing PCR,BSP)法检测IRX3基因5′UTR区甲基化情况。结果表明,肥胖组小鼠腹部脂肪组织IRX3基因相对表达量极显著高于对照组(P<0.01);小鼠腹部脂肪组织IRX3基因5′UTR区甲基化率差异不显著,但有2个位点(-128 bp和-116 bp处)和1个位点(-182 bp处)的甲基化率在所有肥胖小鼠中分别达到62.5%、62.5%和75.0%,极显著高于其他位点。小鼠发生食源性肥胖,IRX3基因mRNA表达上调;食源性肥胖小鼠腹部脂肪组织IRX3基因表达上调与其5′UTR区甲基化率无关;食源性肥胖小鼠腹部脂肪组织IRX3基因5′UTR区3个特异位点的甲基化,可能参与了肥胖的发生。

含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区报告基因载体的构建和鉴定

目的利用pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector(简称为pmirGLO报告基因载体)构建并鉴定含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区报告基因载体(pmir-Insr-3′UTR及pmirmutant-Insr-3′UTR)。方法以大鼠肝脏cDNA为模板,PCR获取目的片段(即含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区);用PmeI、XbaI双酶切pmirGLO报告基因载体和含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR区,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。结果 PCR和双酶切证实pmir-Insr-3′UTR及pmir-mutant-Insr-3′UTR重组载体中均插入目的片段;DNA测序结果进一步证实pmir-Insr-3UTR重组载体中成功插入了胰岛素受体mRNA 3′UTR区,pmir-mutant-Insr-3′UTR重组载体中成功插入了在miR-497结合位点含有3个突变碱基的胰岛素受体mRNA 3′UTR片段。结论成功构建了含miR-497野生及突变结合位点的胰岛素受体mRNA 3′UTR报告基因载体pmir-Insr-3′UTR及pmir-mutant-Insr-3′UTR。

hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统构建

目的:构建hper1基因3′端UTR区双荧光素酶报告系统pmiR-RB-REPORTTM-hper1-3′UTR(PMIR-3′UTR),检测其表达,为研究hper1基因的表达调控及microRNA调控靶基因的结合位点提供基础平台。方法:用PCR扩增的方法提取hper1基因3′UTR序列,并连接至pmiR-RB-REPORTTM(PMIR)双荧光素酶报告载体的多克隆位点,测序验证插入序列并转染入A549细胞检测其荧光素酶活性。结果:测序结果表明PMIR-3′UTR的插入序列正确,在转染入A549细胞后其荧光素酶能正常表达。结论:PMIR-3′UTR双荧光素酶报告系统构建成功。

LGALS3BP 3’UTR荧光素酶报告基因载体构建及鉴定

目的构建LGALS3BP(lectin,galactoside-binding,soluble,3 binding protein,LGALS3BP)基因3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)的野生型及突变型荧光素酶报告基因重组载体并进行鉴定,以备进一步研究miRNA对LGALS3BP基因的调控。方法Targetscan软件预测LGALS3BP 3’UTR上的miRNA结合位点;以人肝癌细胞系SMMC-7721基因组DNA为模板,进行PCR扩增,获得野生型LGALS3BP基因3’UTR片段,经双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆好的重组载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR及测序监定重组子。设计位点突变型LGALS3BP 3’UTR扩增引物,以构建的野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒为模板,采用重叠PCR及定点突变PCR技术进行扩增分别构建单独位点及双位点突变型重组荧光素酶报告基因载体。结果野生型LGALS3BP 3’UTR重组质粒经菌落PCR鉴定,可见871 bp的目的基因片段,大小与预期相符;测序结果表明,插入序列与LGALS3BP 3’UTR序列完全一致且插入方向正确。Targetscan软件预测到LGALS3BP 3’UTR区有两个感兴趣的miRNA结合位点。突变型LGALS3BP 3’UTR重组质粒测序鉴定结果表明,单独位点及双位点突变型重组质粒中均成功引入结合位点突变。结论成功构建LGALS3BP的3’UTR野生型(pGL3-LGAL-W-3’UTR)、两个单独位点突变型(pGL3-LGAL-M1-3’UTR和pGL3-LGAL-M2-3’UTR)及双位点突变型(pGL3-LGAL-M-3’UTR)重组荧光素酶报告基因载体,为后续研究miRNA对LGALS3BP基因的调控奠定基础。

鸭肝炎病毒基因组3′末端序列的克隆和分析

用3′RACE和RT-PCR扩增并克隆鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）Ⅰ型毒株C80和Ⅰ型变异株E63的3′末端序列。分析结果显示,C80株和E63株基因组3′末端均包含1 359 nt的3D、终止密码子TGA、长314nt的3′UTR,而poly（A）尾分别含18个A和19个A。由2株DHV 3D核苷酸序列所推导的3D蛋白均含453个氨基酸,均包含KDELR、DxxxxD、GxxCSGxxxTxxxNS、YGDD和FLKR等小RNA病毒RNA聚合酶的特征基序,该结果进一步证实Ⅰ型DHV属于小RNA病毒科的成员。两株DHV与小RNA病毒科9个已知属之间3D蛋白的氨基酸序列同源性为16%-37%,介于属间3D蛋白的氨基酸序列同源性范围（18%-60%）之内;此外,Ⅰ型DHV的3′UTR在小RNA病毒科是最长的。用3D蛋白进行进化分析的结果表明,Ⅰ型DHV可能属于小RNA病毒科的一个独立的病毒属。

中甸犏牛SLC11A1基因3'非翻译区多态位点研究及其与抗病性关联的评估

为研究中甸犏牛溶质载体转运蛋白基因(SLC11A1)的结构变异情况,并评估结构变异与抗病性的关联,采集了114个样品,扩增了SLC11A1基因3'非翻译区(3'UTR)部分序列,测序共检测到3个微卫星多态位点(MS1、MS2、MS3)和3个核苷酸变异(1 782位点T→G、1 805位点G→A、1 907位点G→T),其中MS1有6个等位基因(GT10、GT12、GT14—17)、MS2有3个等位基因(GT5—7)、MS3有5个等位基因(GT12—16)。GT12/15、GT5/5、GT13/13基因型频率最高,分别为0. 204、0. 05、0. 324; GT15、GT5、GT13等位基因频率最高分别为0. 284、0. 685、0. 433。对MS1、MS2、MS3这3个多态位点进行单倍型分析,发现了44种单倍型,其中GT12/5/13为优势单倍型,频率为0. 13。χ2比较分析表明,中甸犏牛与婆罗门瘤牛×布兰科牛、荷斯坦牛×布兰科牛、布兰科牛、非洲牛MS1位点的GT12/12基因型频率差异显著(P <0. 01),与西班牙黄牛、荷兰黄牛MS3的GT13/13基因型频率差异显著(P <0. 01),与非洲黄牛差异不显著(P> 0. 05)。综上,中甸犏牛SLC11A1基因3'UTR具有丰富的多态性,推断其GT12/12和GT13/13纯合子基因型与抗病性相关。

水稻5.3 kb Gt1启动子克隆以及Gt1启动子引导优质大豆球蛋白Gy7基因表达载体构建

以越光水稻基因组为模板,在成功克隆5.3 kb谷蛋白Gt1基因5’上游和信号肽序列基础上,将其定向插入到pCAMBIA1300质粒中,构建了中间载体p1300-5.3 kb Gt1;再将富含赖氨酸的优质大豆球蛋白Gy7全基因序列及cDNA编码序列分别定向插入p1300-5.3 kb Gt1质粒上Gt1基因信号肽下游,再在2个载体Gy7全基因序列及cDNA编码序列下游都正向插入Gt1 3’UTR,完成由5.3 kb谷蛋白Gt1基因启动子及信号肽引导的大豆球蛋白Gy7基因2种表达载体的构建。此试验为利用转基因技术改良水稻稻米营养品质以及将水稻种子作为生物反应器等方面研究奠定了基础。

β-miR-33a特异调控HADHB基因3′UTR靶标位点验证

为验证β-miR-33a与候选基因HADHB3′UTR是否存在特异性识别的靶标关系,本试验将β-miR-33amimics、β-miR-33ainhibitor及NC质粒分别转染至奶牛乳腺上皮细胞,通过Real-time(qPCR)验证β-miR-33a与HADHB基因mRNA水平表达量的关系。利用PCR获得奶牛HADHB3′UTR 201bp DNA片段,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中,获得野生型载体,利用定点突变技术将HADHB3′UTR种子区-CAATGCA定点突变-CATGTAGC,获得突变型载体。将野生型载体和突变型载体分别与β-miR-33a-mimics组成双荧光素酶报告系统,转染至奶牛乳腺上皮细胞,48h后测定其荧光活性。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞中转染的野生型与突变型载体的双荧光活性存在显著性差异(P<0.05),由此证明,在奶牛乳腺上皮细胞中β-miR-33a可以与HADHB3′UTR的靶位点-CAATGCA特异性结合。

靶向猪ATGL基因的miRNA预测及鉴定

本试验旨在初步筛选出调控猪脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息学分析预测10条靶向ATGL基因的猪miRNAs,然后通过装载含猪ATGL基因3′UTR序列来构建pMIR-Luc报告基因载体,以及通过装载含反向miRNA种子区对应的3′UTR序列来构建3个突变载体作为阴性对照,以pRL-TK载体作为内参,与候选miRNA模拟物共转染HEK 293T细胞,最终利用双荧光素酶报告基因法来检测荧光素酶活性。试验成功构建了含猪ATGL基因3′UTR序列的重组载体pMIR-ATGL-3′UTR,双荧光素酶报告基因试验显示sscmiR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下调293T细胞中pMIR-ATGL-3′UTR的荧光素酶活性,而点突变试验证实了ssc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p能通过与猪ATGL基因3′UTR上预测的种子区结合下调荧光素酶活性。结果表明,sc-miR-1343与ssc-miR-7137-3p通过靶向结合3′UTR对猪ATGL基因有下调作用。

哺乳动物基因非翻译区开放阅读框架的分析

在所分析的5’UTR序列中约19%的序列在阅读框1下含有AUG,约22%和24%的序列分别在阅读框2和阅读框3下含有AUG,而在3’UTR序列当中,无论是在哪个阅读框下,约71%含有AUG.这些AUG绝大多数都是以小ORF的形式出现的;分析小ORF序列以及与它们相应的IC序列(阅读框间序列)长度,发现虽然3’UTR序列远远长于5’UTR序列,但是它们所包含的小ORF长度几乎没有差距,只是平均来说每一条3’UTR序列所包含的小ORF数量明显多于每一条5’UTR序列所包含的小ORF数量,而且dIC(下游阅读框间序列)比uIC(上游阅读框间序列)长很多,平均长50个碱基;第二类IC序列(UTR区相邻的两个阅读框之间的序列)的平均长度比其它两类IC序列(UTR区最后一个阅读框之后的序列)的平均长度小,而且又含有相对较多的终止密码;比较uORF序列与dORF序列密码子使用偏好的CAI值发现,尽管相差不大,但是无论在哪个阅读框下,uORF序列的CAI值都显著高于dORF序列的CAI值.

NRAMP1基因3′UTR多态现象与汉族结核病易感性的研究

目的 研究人类自然抵抗相关巨噬细胞蛋白 (NRAMP1)基因 3′UTR多态现象与汉族结核病易感性的关系。方法 选取汉族活动性结核病患者 14 7例 ,正常对照 14 5人 ,用聚合酶链反应 限制性片断长度多态性 (PCR RFLP)的方法对NRAMP1基因 3′UTR进行基因分型 ,根据基因型对样本分组 ,经统计学处理 ,研究 3′UTR多态现象与结核病易感性的关系。结果 在活动性结核病患者中 3′UTRTGTG/TGTG基因型 95例 (6 4 6 % ) ,TGTG/TGTG缺失基因型 5 0例 (34 0 % ) ,TGTG缺失 /TGTG缺失基因型 2例 (1 4 % ) ;正常对照TGTG/TGTG基因型则为 115例 (79 3% ) ,TGTG/TGTG缺失基因型 2 9例 (2 0 .0 % ) ,TGTG缺失 /TGTG缺失基因型 1例 (0 7% )。正常对照组TGTG/TGTG基因型明显高于结核病患者 (χ2 =7 79;P <0 0 1)。研究发现TGTG的等位基因频率为 0 85 ,TGTG缺失的等位基因频率为 0 15。结论 NRAMP1基因 3′UTR多态现象与结核病易感性相关 ,汉族 3′UTRTGTG缺失等位基因频率明显高于白种人 ,可部分解释汉族比白种人更易患结核病。

鸡CFL2基因3′UTR多态性与肉质性状的关联分析

以固始鸡×安卡鸡F2代资源群为研究对象,利用PCR-RFLP方法检测鸡CFL2基因3′UTR多态性,并将不同基因型与肉质性状进行相关性分析。结果表明:在鸡CFL2基因3′UTR区预测到5个microRNA靶位点。在CFL2基因3′UTR区发现G577A位点,该位点为KpnⅠ自然酶切位点,表现为GG、AA和GA 3种基因型,基因型频率分别为0.589、0.349和0.061,经χ2适合性检验,该位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。该突变位点对鸡的腿肌肌纤维密度和肌纤维直径具有显著影响(P<0.05)。结果显示,CFL2基因对鸡的腿肌肌纤维性状有一定影响,同时为该基因的标记辅助育种和进一步研究提供参考。