短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。

寻常性银屑病患者HAX-1基因多态性的研究

目的通过检测HAX-1基因序列研究基因多态性与银屑病的相关性。方法提取银屑病患者(247例)和正常人(102例)基因组DNA并进行扩增,通过自动测序的方法测定HAX-1基因及启动子区域的序列,检测其SNP位点,并以SPSS软件进行统计处理。结果①测序结果:测序总长度5313bp,发现1个位于5’UTR的高频SNP。②病例-对照关联分析结果:5’UTR区的SNP位点-104T>G多态性的T等位基因频率在寻常性银屑病患者组和正常对照组间的频率分别为53.4%和48.5%,在两组间无显著性差异(P>0.05)。结论银屑病患者与正常人HAX-1基因5’UTR区的SNP位点-104T>G基因频率无显著差异。

HAX-1对Jurkat细胞的抗凋亡作用研究

目的研究HAX-1过表达在T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞中的抗凋亡作用。方法构建HAX-1真核表达载体pEGFP-C3-HAX-1并转染Jurkat细胞。分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测HAX-1的表达,然后通过光镜、电镜以及TUNEL法检测在去血清培养、电子线照射以及地塞米松诱导等不同处理因素下HAX-1过表达Jurkat细胞的凋亡情况。结果构建的表达载体经酶切和测序鉴定序列正确,载体构建成功;PCR及Western blot结果表明,转染后HAX-1的表达水平明显高于对照组(P<0.01);经检测过表达HAX-1的Jurkat细胞具有明显的抗凋亡作用,能够对抗去血清培养、电子线照射以及地塞米松诱导等的凋亡诱导作用。结论HAX-1基因在Jurkat细胞中过表达具有明显的抗凋亡作用。

HAX-1对MRL／lpr小鼠狼疮活动性影响的研究

目的观察抗凋亡蛋白HAX-1对MRL／lpr狼疮鼠狼疮活动性的影响。方法重组腺病毒AdHAX-1经腹腔注射MRL／lpr小鼠，每周2次，连续注射4周。分别在注射前、注射2周后及4周后检测小鼠血清中抗核抗体（ANA）、循环免疫复合物（CIC）、抗双链DNA抗体（抗dsDNA抗体）、抗组蛋白抗体和干扰素γ（IFN-γ）水平，并检测注射前及注射后外周血的白细胞计数及尿蛋白水平；经RNAi使HAX-1表达下调后，观察脾脏淋巴细胞的增殖以及IFN-γ的分泌水平。结果HAX-1可使MRL／lpr小鼠的尿蛋白以及抗dsDNA抗体、ANA、抗组蛋白抗体、CIC明显升高，且产生IFN-γ水平升高，除抗组蛋白抗体及CIC外，其余指标与磷酸盐缓冲液对照组（PBS组）及对照腺病毒组（AdEGFP组）相比较，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。重组腺病毒组（AdHax-1组）小鼠肾小球内免疫复合物沉积强度明显较强且阳性肾小球数目较多，与对照组比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）。AdHax-1组肾小球的平均病变积分达1．50±0．34，与对照组（PBS组：0．67±0．14；AdEGFP组：0．81±0．26）比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。pGenesil-HAX-1可使淋巴细胞的增殖率明显降低（P〈0．05），IFN-γ分泌水平明显下降（P〈0．01）。结论HAX-1是调节系统性红斑狼疮淋巴细胞凋亡的一个重要因素，重组AdHAX-1可使MRL／lpr小鼠狼疮样症状加重，下调HAX-1表达可使病情减轻。