2022年深圳市5株肠道腺病毒41型(HAdV-41)的分子特征分析

人腺病毒41型(Human adenovirus,HAdV-F41)是儿童胃肠炎的常见病因,但目前HAdV-F41的分子特征尚未得到详细研究。本研究选取2022年2-5月的5个儿童急性腹泻患者的粪便样本,进行高通量测序得到全基因组序列。5个深圳株与参考株Tak(DQ315364)的核苷酸序列同一性为97.5%~98.6%,在四个重要结构基因中无核苷酸的插入和缺失,有2株在Hexon基因可见ε抗原表位发生突变,可能使毒株出现免疫逃逸,出现显著突变的基因区域还有E2A、L4、L5和E4。从NCBI上下载37个完整的HAdV-41全基因组序列建立系统发育树。系统发育树主要分为四个进化分支,其中分支1和分支2是主要的流行分支,5株深圳株处于这两个分支上。在5株深圳株中未发现有明显重组现象。

2010⁃2019年北京地区腹泻患儿中人腺病毒41型Fiber基因分子特征和进化分析

人腺病毒41型(Human adenovirus 41,HAdV-41)是引起儿童腹泻的重要病原之一。为了解北京地区腹泻儿童中HAdV-41 Fiber基因的分子变异和遗传进化特征,选取2010-2019年首都儿科研究所附属儿童医院门诊腹泻患儿HAdV-41阳性的粪便标本,扩增Fiber全基因,使用多种生物信息学软件进行系统发生、遗传进化、种群演变和选择压力等分析。结果显示HAdV-41本地毒株存在1644碱基(547氨基酸)和1689碱基(562氨基酸)两种长度的Fiber基因,截短的15个氨基酸位于Fiber蛋白纤维轴区。Mann-Whitney U秩和检验提示检测到感染短Fiber基因的HAdV-41的患儿年龄更小(P=0.036)。同源性分析结果显示Fiber基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均大于97%,主要分为四个进化分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),其中Ⅰ和Ⅲ是主要的流行分支,分支Ⅰ主要在国内流行,而分支Ⅲ全球均有流行。HAdV-41共祖起源可追溯到1856年,平均进化速率每年为6.81×10^(-5)碱基替换/位点,10年间理论有效种群一直比较平稳呈缓慢下降趋势。压力选择分析表明,一个正向和三个负向选择位点均位于Fiber蛋白的纤维轴区。上述结果表明2010-2019年间不同进化分支的HAdV-41在北京地区流行,进化速率稳定。Fiber蛋白轴区存在两种不同类型的氨基酸缺失。

南通地区腺病毒41型遗传变异及进化特征分析

F亚属的人类腺病毒(Human adenovirus,HAdV)与急性胃肠炎相关,是儿童急性胃肠炎住院的常见病因。本研究收集了712份<5岁儿童急性胃肠炎腹泻监测粪便标本,检出HAdV-F阳性52例,阳性检出率为7.30%。对Ct值<30的样本进行文库构建及测序,经Blast比对,得到的21条全基因组序列均为HAdV-41。与HAdV-41原型株相比较,Long fiber和Short fiber的核苷酸一致性低于全基因组核苷酸一致性。对HAdV-41全基因组的遗传进化分析显示,其分子进化速率为7.882×10^(-5)替换/位点/年(95%HPD,3.885×10^(-5)~1.234×10^(-4))。本课题研究对南通地区流行的HAdV-41进行了流行病学特征及基因进化特征分析,为南通地区HAdV-41所致疾病防控及病原溯源奠定了基础。

利用293细胞拯救和扩增重组人41型腺病毒

人41型腺病毒(Human adenovirus type 41,HAdV-41)为难养腺病毒,E1区缺失的HAdV-41无法在293细胞中拯救并扩增,本研究试图通过反向遗传学操作获得能够在293细胞中拯救并扩增的重组HAdV-41。首先,对原有的骨架质粒pAdbone41进行改造:通过重叠延伸PCR方法将HAdV-41的E3区基因替换为HAdV-5E4orf6编码区;将HAdV-5E1A增强子克隆至HAdV-41E4区启动子上游,获得新的骨架质粒pAdbone41E4EE。该骨架质粒与线性化的穿梭质粒pSh41-GFP在E.coli BJ5183菌株同源重组得到腺病毒质粒pAd41E4EE-GFP。pAd41E4EE-GFP经Pme I酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组病毒HAdV-41-E4EE-GFP。经过7轮扩增,超速离心纯化后获得1.0ml浓度为8.0×10^(10) vp/mL的重组腺病毒,其感染滴度为1.7×10~9 IU/mL,电子显微镜下观察可见形态完整的病毒颗粒,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定结果均表明携带HAdV-5E4orf6基因与E1A增强子基因的重组腺病毒载体构建正确。本研究利用反向遗传学技术对病毒载体进行改造,实现了在293细胞中培养E1区缺失的HAdV-41的目的。