不同猪种肉质相关基因Hal、RN和FTO的多态性研究

为了明确肉质相关基因氟烷基因(Hal)、酸肉基因(RN)和脂肪肥胖相关基因(FTO)在国内外不同猪种群体间的遗传变异特性,本研究以大约克、长白、杜洛克和金华猪等猪种群体为研究对象,应用PCR-RFLP技术分别检测了Hal、RN和FTO基因的多态性,并分析了FTO基因上2个多态位点g.276G>T和c.594C>G的遗传变异情况。结果表明:(1)在杜洛克猪中发现了Hal的基因型Hal NHal n,其频率为0.166,但未发现基因型Hal n Hal n,其它猪种群体中仅检测到了基因型Hal NHal N;(2)在已检测的所有猪种群体中只检测到RN基因的rn/rn基因型,未发现rn/RN和RN/RN基因型;(3)在FTO的g.276G>T位点上,金华猪呈现单态,其它猪种群体均呈现多态。在FTO的c.594C>G位点上,4个猪种群体均呈现多态,3个外来猪种群体均以CC基因型频率较高,而金华猪则以GG基因型频率较高。研究结果提示,由于Hal基因在养猪生产中的利弊双重性,因此在某些猪种群体中仍然存在较高频率的Hal NHal n基因型。此外,结合FTO基因的生理功能和已有的研究结果,可在特定的猪群中将其作为影响猪肉质性状的候选基因。本研究发现FTO的基因型分布在我国优良地方猪种金华猪与国外3个种猪群间存在较大差异,为深入研究不同品种猪的肉质形成机理提供了基础数据。

HAL1基因转化番茄及耐盐转基因番茄的鉴定

采用PCR方法 ,从啤酒酵母中扩增得到可调节植物细胞离子均衡的HAL1基因 ,克隆后序列分析表明 :其开放读码框全长 879bp ,编码一个 2 94个氨基酸的多肽 (分子量 3 2kD)。构建含HAL1和NptⅡ嵌合基因的植物表达框架pRH ,三亲杂交后经农杆菌介导的叶圆盘法转化番茄 (中蔬 5号 ) ,在含卡那霉素的培养基上进行转化体的筛选。转基因番茄的PCR、Southern杂交、RT PCR检测以及鲜重、干重和Na+ 、K+ 含量的测定表明 :HAL1基因确已整合到一些转基因番茄的基因组中 ;且转基因植株的耐盐性提高。

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。

HAL1基因转化烟草及其耐盐性

利用含HAL1基因的高效植物表达载体pAHF转化根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens,LBA4 4 0 4 ) ,用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草 (NicotianatabacumL .)叶片进行遗传转化。在含卡那霉素的MS分化培养基上选择转化体和植株再生 ,转化植株可在含卡那霉素的生根培养基中生根。经PCR检测发现 ,在 8个转化子中有 6个转化子获得特异性扩增条带。耐盐试验表明 ,在被检测的 90 0株转化子中有 4 81株可在含 0 .80 %～ 1.5 0 %NaCl的生根培养基中生根 ,生根率为 5 3.4 5 % ,对照烟草植株只在低于 0 .80 %NaCl的生根培养基中生根 ,生根率为 73.75 %。由此证明HAL1基因的转入提高了烟草的耐盐性。

宁乡猪肉质性状相关氟烷基因Hal多态性研究

为探讨宁乡猪肉质相关氟烷基因(Halothane gene,Hal)遗传多态性,利用PCR-RFLP检测该基因Hha I位点的多态性;结果表明,在宁乡猪中均只检测到了显性纯合子Hal^NHal^N。与之比较,在781个大白猪的样本中检测到杂合子Hal^NHal^n,基因型频率是0.003 8,但未发现隐性纯合子Hal^nHal^n。本研究为宁乡猪肉质性状深入的研究打下基础。

HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。

转HAL1基因番茄的耐盐性

利用农杆菌介导的叶盘法 ,把HAL1基因转入番茄 ,Southern杂交检测得到转基因植株。耐盐实验表明 ,T1代转基因番茄在 15 0mmol/L的NaCl胁迫下仍有 4 3%的发芽率 ,2 0 0mmol/L的NaCl胁迫下发芽率为 6 % ,而对照种子在 10 0和 15 0mmol/L的NaCl胁迫下发芽率分别为 11.0 %和 0。转基因番茄的电解质相对外渗率小于对照 ,而根冠比和叶绿素含量大于对照 ,转HAL1基因显著提高了番茄的耐盐性。盐胁迫下Na+ 、K + 的累积状况表明 ,转基因番茄根、茎、叶的K+ /Na + 均有所提高 ,根系的SK/Na 增大 ,茎、叶的RSK/Na和RLK/Na减小 ,说明根系对K + /Na+ 离子的选择吸收和运输能力加强。不但选择吸收K + /Na+ ,而且表现出整株水平上的有利于耐盐的K + /Na+

HAL1基因转化苜蓿再生植株及其耐盐性

用根癌农杆菌介导法将克隆于酵母的HAL1基因转化龙牧803苜蓿胚性愈伤组织,经2 mg/L的Basta抗性筛选及PCR检测,该基因已整合到受体基因组中,共获得了11株转基因植株。培养基耐盐性实验结果:在添加NaCl的MSO培养基上,非转基因植株在NaCl浓度高于0.6%时不能生根,逐渐死亡;转基因植株在NaCl浓度0.6%～1.0%范围内仍能生根并正常生长。由此初步证明HAL1基因已在龙牧803苜蓿中表达,并且提高了耐盐性。

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2 .375菌株的DNA为模板 ,根据已发表的序列设计引物 ,经PCR扩增得到约 90 0bp的HAL1基因片段 ,连接到 pMD1 8 T载体上 ,转化大肠杆菌JM 1 0 9,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定 ,结果显示已克隆到完整的可读框 ,该基因的序列与已知序列同源性达 99%。将HAL1基因从T 载体上切下连接到pAM 1 94载体上构建了HAL1基因的植物表达载体 ,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。

基因工程根瘤菌表达融合蛋白GST-HAL1条件的优化及耐盐水平的提高

利用原核表达载体pGEX-4T-1构建重组质粒载体pGEX-HAL1,三亲本杂交转化根瘤菌,表达融合蛋白GST-HAL1。结果表明,与空白菌和未诱导工程根瘤菌相比,诱导后工程根瘤菌的耐盐水平有明显提高。通过检测不同温度、不同诱导时间和不同IPTG诱导浓度条件下融合蛋白的表达量,优化各个参数。在28℃的温度条件下,融合蛋白GST-HAL1表达量明显增加;在IPTG浓度为1.0 mmol.L-1,诱导时间为3 h的条件下,融合蛋白的表达量最高,培养基产生的融合蛋白为3.02 mg.L-1,占可溶性蛋白质的39.34%。本研究对今后利用基因工程技术研制新型生物肥料做了有益的尝试。

耐盐基因Hal1的克隆及表达载体的构建

以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板,利用PCR方法,扩增出耐盐基因Hal1,测序表明该基因全长为885个核苷酸,与已发表的序列NC_001148比较,同源性99.3%。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间,构建表达载体pYES2-Hal1,序列测定完全正确,为植物表达载体的构建打下基础。

6个主效基因在苏钟猪分子育种中的应用价值

利用PCR-RFLP方法检测了Hal基因、RN基因、ESR基因、FSHβ基因、IGF-1基因及MC4R基因在苏钟猪(180头)、二花脸猪(64头)、梅山猪(60头)、长白猪(46头)、大白猪(48头)和皮特兰猪(35头)猪群中的多态性,探讨了这6个主效基因在苏钟猪分子育种中的应用价值。结果显示:各主效基因在试验猪群中均表现不同程度多态性;其中,在苏钟猪群中Hal基因检测到NN、Nn基因型,RN基因表现为RN-/rn+、rn+/rn+基因型,ESR基因、FSHβ基因、IGF-1基因及MC4R基因分别检测到相关性状优势基因型。这些结果预示各主效基因在苏钟猪分子选育中具有应用价值。

2006年河北省新分离Victoria系B型流感病毒变异株血凝素基因序列分析

目的分析2006年河北省分离的B型流感毒株HA抗原性和基因特性,阐明HA基因的变异与流感流行的关系。方法用MDCK(Madin Darby Canine Kidney)细胞分离培养流感病毒,血凝抑制(Hemasslutination Inhibition,HI)试验鉴定型别。提取病毒核糖核酸(RNA),采用RT-PCR扩增病毒HA基因,纯化产物进行核苷酸序列测定,用DNAStar软件作分析处理。结果2006年在河北省流行的B型流感病毒属Victoria系,与北半球该流行期的国际疫苗株B/上海/361/02不同,其抗原性与最近的Victoria系代表株B/Hong Kong/330/2001相比已发生较大变异,核苷酸同源性仅为96.5%～97.2%,在抗原决定簇上有6个位点发生了氨基酸替换。结论2006年在河北省流行的Victoria系B型流感病毒是一个新的变种,在HA1区域发生的变异是今年B型流感流行的主要原因,应该引起重视。

云南省2009年至2014年B型流感毒株血凝素基因进化分析

目的了解云南省2009年至2014年B型流感病毒血凝素(HA1)基因突变及其抗原变异情况.方法将云南省2009年至2014年流感哨点监测医院采集的流感样病例咽拭子进行病毒分离,随机抽取12株B型流感病毒进行HA1基因序列测定,并对测序产物进行分析,通过MEGA软件进行同源性比对、构建HA基因进化树.结果云南省流感毒株血清型和基因型鉴定有差异,可能是由于基因变异后量的积累量不够引起.在HA1蛋白的抗原决定簇的3个重要区域120环,150环和160环都有氨基酸的变异.云南省流感毒株在120环的131位置氨基酸变异为N131K,137位置B-Victoria系氨基酸发生了N137H的变异,187位置有2株发生了P187S的变异.结论云南省的B型流感毒株在血凝素基因重要位置发生了多处变异,有和疫苗株相同的变异,也有不同于疫苗株的变异.

圩猪及其二元杂交品种猪氟烷基因的基因频率分析

试验采用PCR-RFLP分子标记技术检测了圩猪(62头)、长白(64头)、杜洛克(61头)、英系大约克(60头)以及长圩零世代(65头)、一世代(121头)、二世代(243头)共676头猪的Hal基因基因型的分布情况。结果表明,在检测的各猪种中,Hal基因显性纯合子频率分别为:1.00,0.71,0.80,0.62,0.91,0.88,0.82;杂合子频率分别为:0,0.29,0.20,0.37,0.09,0.12,0.18。由此说明,虽然氟烷敏感基因频率和基因型频率在长圩3个世代猪种中分布均较低,但Haln基因频率和HalNHaln基因型频率在长圩3个世代中仍呈上升趋势,应进一步采用标记辅助选择方法降低Haln基因频率,直至完全剔除Haln基因。

四川省一个新引进外种猪群体氟烷基因及酸肉基因的检测和分析

为了加强对四川省某核心种猪场新引进种猪的选育,试验采用PCR-RFLPs方法对新引进的457头外种猪的氟烷(HAL)基因和酸肉(RN)基因的多态性进行研究。结果表明:新引进种猪中存在3头HALn基因携带者,HALn基因频率为0.33%。RN-rn+、RN-RN-基因型种猪数分别为1头、38头,在整个群体中RN-的基因频率为8.42%。在今后的育种工作中,应加强对氟烷基因和酸肉基因的检测和标记辅助选择(MAS),以选育出抗应激的优质猪群体。

酵母HAL1基因转化水稻及其耐碱性研究

利用农杆菌介导的遗传转化法,将从啤酒酵母中克隆出能调节细胞K+/Na+的基因HAL1导入吉林省主栽粳稻品种吉粳88和吉粳83中,经PCR、Southern杂交检测,获得246株转基因阳性植株。转基因水稻在p H值为11.0的Na OH和Na2CO3碱性胁迫下,吉粳83的转基因植株耐盐碱性为1级的有7株,3级的有29株;吉粳88的转基因植株耐盐碱性为1级的有6株,3级的有8株。

抗应激系种猪的选育

为了选育出抗应激系种猪,降低猪应激综合征的发生频率,试验采用PCR-RFLP技术对天津市宁河原种猪场种猪进行基因型的鉴定,剔除含有氟烷(HAL)隐性纯合子基因型的猪只,净化猪群。研究表明:该地区种猪氟烷隐性基因的基因频率为0,说明该种猪群已实现对含有氟烷隐性基因猪只的剔除。猪氟烷基因PCR-RFLP分析技术为选育抗应激系种猪提供了快捷、高效的选育方法。

秦烟遗传转化体系的优化

【目的】优化烟草的高效遗传转化体系。【方法】以陕西地区广泛种植的烟草品种秦烟98为试材，采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，LBA4404）介导法，将从酿酒酵母细胞中克隆到的具有较强耐盐表型的HAL1基因进行遗传转化，对农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素进行研究。【结果】用50mg／L卡那霉素（Kan）筛选转化外植体用800mg／L羧苄青霉素（Cb）除菌可以获得理想的筛选和除菌效果。以优化的农杆菌介导烟草叶片的遗传转化条件为：将未经过预培养（预培养0d）的外植体用稀释150倍的农杆菌菌液（OD600=0．5）浸泡15min，转至MS1培养基上共培养48h，用无菌水冲洗后于体积分数2％NaCIO中浸泡15min，用无菌水冲洗4～5次，置800mg／LCb＋质量分数0．1％的甘露醇中浸泡约12h除菌。【结论】获得了农杆菌介导烟草叶片遗传转化的最佳优化条件，有效地减少了外植体的污染率，提高了抗性芽分化率。

产绿原酸内生菌的分离及其绿原酸合成途径关键基因的克隆和功能研究

【目的】分离产绿原酸的内生菌并对其绿原酸合成途径的一种关键酶基因进行克隆和功能研究。【方法】采用表面消毒法从金银花中分离内生菌,以高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)筛选确定产绿原酸的内生菌,克隆、表达该内生菌的组氨酸解氨基酶(HAL)并进行酶活测定。【结果】从金银花根中分离到一株产绿原酸的内生细菌RP1,同时在该内生菌发酵液中检测到了绿原酸代谢的中间物肉桂酸。对RP1的分子鉴定表明该内生菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对RP1的HAL基因进行克隆和原核表达,酶活测定表明该酶具有HAL和PAL(苯丙氨酸解氨基酶)双功能,其PAL活性产生的肉桂酸与LC-MS检测的结果一致。【结论】推测该内生菌可能利用其HAL的苯丙氨酸解氨基活性将苯丙氨酸的催化产物肉桂酸导入苯丙烷途径,从而产生绿原酸。