信号肽重组HBD2在人肺癌细胞中表达的初步研究

目的 构建高表达人源化β 防御素 2 (HBD2 )表达体系。 方法 构建人pLNCX2 CEA信号肽 HBD2 (成熟肽 )逆转录表达载体 ,DOTAP转染逆转录包装细胞 ,获得含融合基因的侵袭性逆转录病毒 ,再转染人肺癌A5 4 9细胞 ,用免疫印迹法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达。结果 成功构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人肺癌表达体系 ,经WesternBlot检测 ,证实有目的基因表达。

CEA-HBD2重组基因在人结肠癌细胞中表达初步研究

目的 构建高表达人源化HBD2人结肠癌表达体系 .方法 构建人pLNCX2 -CEA信号肽—HBD2抗菌肽(成熟肽序列 )逆转录表达载体 ,DOTAP转染逆转录包装细胞 ,产生的含融合基因的侵袭性逆转录病毒 ,转染人结肠癌HCT116细胞 ,用免疫印迹法法鉴定转化细胞中HBD2蛋白的表达 .结果 正确构建了表达HBD2成熟肽的重组信号肽HBD2的人结肠癌表达体系 ,并出现正确的目的基因表达 .结论 此HBD2表达体系表达的特异性多肽经纯化后 。

新型非病毒载体O-CHCS携带HBD2转染L929细胞及表达产物活性检测

目的研究O-胆甾醇基壳聚糖(O-CHCS)作为基因载体进行人β防御素-2(HBD2)基因转染小鼠纤维母细胞L929的可行性及检测目的基因表达产物的生物活性。方法构建重组质粒pCMV-hBD2,通过O-CHCS介导转染于L929细胞,提取转染细胞总RNA,用RT-PCR检测HBD2基因转录水平;收集转染细胞培养上清液,用Westernblotting检测HBD2基因蛋白的表达;用Kirby-Bauer纸片法检测HBD2抗菌活性,同时以Lipofect脂质体转染试剂作为阳性对照。结果经过O-CHCS介导转染的L929细胞,目的基因HBD2在转录水平和蛋白水平均有表达,转染细胞上清液对金黄色葡萄球菌有抑菌圈形成,结果同Lipofect的转染效果基本一致。结论成功构建了真核表达载体pCMV-hBD2,证实了O-CHCS可以作为基因载体用于目的基因HBD2的转染,且目的基因表达产物具有生物活性,为基因工程合成HBD2提供一条经济便捷的途径。

人β防御素2(HBD2)与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的 构建人β防御素与人乳头瘤病毒 HPV16 E6羧基端基因的真核表达质粒 ,并检测其在真核细胞中的表达情况 ,探讨其作为 DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性。方法 利用分子克隆技术 ,将 HBD2基因片段与 HPV16 E6羧基端基因片段连接 ,插入真核表达质粒 pc DNA3.1,经测序鉴定后 ,用阳离子脂质体法转染真核细胞 COS7,RT- PCR及免疫组化法检测其表达。结果 重组质粒 pc DNA3.1/ HBD2 - HPV16 E6 C转染 COS7细胞 4 8小时后 ,RT- PCR扩增出插入的 HBD2 - HPV16 E6 C片段 ,免疫组化染色呈棕黄色阳性反应。结论 人 β防御素与人乳头瘤病毒 HPV16 E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达 ,为今后进行整体动物 DNA免疫试验奠定了基础。

稽留流产患者绒毛组织中TLR4、NF-κB和HBD2的表达及其相关性

稽留流产是常见的病理性妊娠之一，病因复杂，发病机制尚未完全阐明。生殖免疫学认为，稽留流产是母胎间免疫平衡失调，母体对胎儿产生免疫排斥的结果。Toll样受体4（Toll—likereceptor4，TLR4）是天然免疫系统中一类重要的模式识别受体，研究发现，滋养细胞能够表达TLR4；TLR4通过。

TLR4、SIRT6、HBD2在胎膜早破患者胎膜组织中的表达变化及其相关性研究

目的探讨胎膜早破患者胎膜组织中TLR4、SIRT6、HBD2的表达特点,分析TLR4、SIRT6、HBD2的相关性。方法以2015年2月至2017年10月江苏省淮安市妇幼保健院收治的138例胎膜早破患者作为研究对象,根据胎膜早破时间及是否发生组织学绒毛膜羊膜炎(HCA)分组,并以同期50例正常足月妊娠孕妇为对照组,免疫组化法检测研究对象胎膜组织中TLR4、SIRT6、HBD2表达及其相关性。结果与对照组相比,胎膜早破组TLR4、HBD2表达增高SIRT6表达水平下降(P<0.05)。与非HCA组相比,HCA组TLR4、HBD2表达增高、SIRT6表达下降(P<0.05)。TLR4、HBD2与SIRT6呈负相关(r=-0.301、-0.296,P<0.05),TLR4与HBD2呈正相关(r=0.435,P<0.05)。结论胎膜早破患者胎膜组织TLR4、HBD2表达上调,SIRT6表达下调,TLR4、SIRT6、HBD2与胎膜早破的发密切相关。

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的构建和鉴定人β防御素2(HBD2)的重组腺病毒表达载体,并观察其转染大鼠真皮多能干细胞(dMSCs)后的表达。方法反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HBD2全长cDNA,亚克隆至穿梭质粒(pAdTrack-CMV)中,然后转化含骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌B J5183,通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞,包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞,并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果经测序、酶切及聚合酶链反应(PCR)鉴定,表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA,并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中,进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs,并有效表达HBD2。结论本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体,并证实其可在dMSCs中表达。

重组人β防御素2工程菌的发酵及纯化研究

目的发酵并纯化重组人β-防御素2(HBD2),为其生物活性的检定奠定基础。方法利用罐发酵人β-防御素2工程菌,并建立重组人β-防御素2的层析纯化工艺。结果确定了工程菌优化的最佳发酵条件为高溶氧、低温诱导策略,获得了高密度发酵工艺。建立了重组人β-防御素2的特殊纯化工艺。结论完成了重组人β-防御素2的发酵和纯化工艺研究。

抗Her-2抗体与人β防御素Ⅱ融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

利用小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)融合表达系统,在大肠杆菌Origami B(DE3)中表达人β防御素Ⅱ(humanβdefensin 2,HBD2)与抗人表皮生长因子受体2(Her-2)单链抗体(4D5 scFv)的融合蛋白。经20℃,l mmol/L IPTG诱导24 h后,获得相对分子质量约为41 kD的SUMO-HBD2-4D5融合蛋白,为可溶性表达,表达量占菌体上清总蛋白的42.2%。利用组氨酸亲和凝胶色谱(Ni-NTAsepharose)、特异性SUMO蛋白酶(SUMO protease)酶切和分子筛(Sephadex G-25)联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白HBD2-4D5,其最终得率达到15 mg/L。HBD2-4D5 200μg对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和大肠杆菌K12D31具有较明显的杀伤作用。免疫荧光分析结果显示,HBD2-4D5蛋白能结合于Her-2高表达的人乳腺癌细胞SK-BR-3表面。本实验表达的HBD2-4D5双功能蛋白具有较好的抗菌活性和特异性结合SK-BR-3表面Her-2的能力,为日后用于靶向治疗Her-2高表达的肿瘤疾病提供研究基础。

麻杏石甘汤灌肠治疗婴幼儿肺炎喘嗽的临床疗效及肺-肠微环境干预机制

目的:观察麻杏石甘汤灌肠治疗婴幼儿风热闭肺型肺炎喘嗽(病毒性肺炎)的临床疗效,对比患儿肠道菌群、唾液中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、人β-防御素2(hBD2)及粪便中钙卫蛋白(CALP)浓度的变化,综合评价中药灌肠对婴幼儿肠道微环境的影响作用,进一步明确灌肠疗法治疗肺炎喘嗽的作用机制。方法:选取病毒性肺炎婴幼儿60例,随机分为3组,中药2组灌肠药物剂量一致(3.5 g/次),中药高浓度组以高浓度灌肠液灌肠(0.117 g·mL^(-1)),中药低浓度组以低浓度灌肠液灌肠(0.07 g·mL^(-1));对照组灌肠适温生理盐水,每日1次,疗程7 d。观察各组的疗效、总症状积分、唾液sIgA、hBD2和粪便CALP水平,综合评估中药灌肠治疗肺炎喘嗽患儿的临床疗效。结果:中药高浓度组总有效率100%(20/20),与中药低浓度组总有效率95%(19/20),两组疗效相当,且两组均高于对照组的70%(14/20),差异具有统计学意义(高浓度组χ^(2)=7.059、低浓度组χ^(2)=4.329,P<0.017)。治疗后,与对照组和中药低浓度组比较,中药高浓度组患儿症状积分明显升高(P<0.05,P<0.01)。3组患儿经治疗后均可降低肠道菌群球杆比值且高浓度组和低浓度组的肠道菌群球杆比值均低于对照组(P<0.05)。3组治疗后均可提高唾液sIgA浓度(P<0.05),且与对照组、中药低浓度组比较,中药高浓度组sIgA浓度显著升高(P<0.01)。治疗后3组均可降低唾液hBD2浓度,与对照组比较,中药低、高浓度组hBD2浓度均明显降低(P<0.05)。治疗后3组均可降低粪便CALP浓度(P<0.05);与对照组比较,中药低、高浓度组CALP浓度显著降低(P<0.01);与低浓度组比较,高浓度组CALP浓度显著降低(P<0.01)。结论:麻杏石甘汤灌肠和西药对症治疗均对肺炎喘嗽患儿的临床症状有改善作用,且麻杏石甘汤灌肠明显优于西药对症治疗。麻杏石甘汤灌肠和西药对症治疗均可改善肠道菌群、降低患儿机体炎症,且麻杏石甘汤灌肠明显优于单纯西药对症治疗。麻杏石甘汤灌肠与单纯西药对症治疗比较,可以更好地提高患儿的黏膜免疫功能。麻杏石甘汤灌肠高浓度比低浓度具有更好的疗效。中药灌肠操作简便,婴幼儿依从性高,治疗效果显著,在临床中安全可靠,值得临床推广。

香菇多糖诱导人肺腺上皮细胞β-防御素-2基因表达的研究

探讨香菇多糖诱导人肺腺上皮细胞的人-β-防御素-2(HBD-2)基因表达的情况。香菇多糖体外刺激人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)后,应用RT-PCR技术检测SPC-A-1细胞HBD-2 mRNA的表达。香菇多糖可上调人肺腺上皮细胞(SPC-A-1)HBD-2 mRNA的表达;这种增强表达与药物的刺激剂量和刺激时间具有一定的相关性。