龈沟液SFRP1、hBD3、肿瘤坏死因子-α在慢性牙周炎伴Hp感染患者中表达及临床意义

目的探讨龈沟液分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)、β防御素3(hBD3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在慢性牙周炎伴幽门螺杆菌(Hp)感染患者中表达及意义。方法选取2017年7月至2019年9月本院收治的167例慢性牙周炎患者,根据是否伴有Hp感染分为对照组(无Hp感染,105例)、Hp感染组(慢性牙周炎伴Hp感染,62例),比较两组龈沟液SFRP1、hBD3、TNF-α表达,采用Logistic、Spearman、接收者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)进行统计分析。结果 Hp感染组SFRP1、TNF-α高于对照组,hBD3低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);龈沟液SFRP1、hBD3、TNF-α与慢性牙周炎合并Hp感染有呈正相关(P<0.05);龈沟液SFRP1、TNF-α与Hp感染程度呈正相关,hBD3与Hp感染程度呈负相关(P<0.05);SFRP1预测疗效的AUC为0.746(95%CI:0.619~0.848),hBD3预测疗效的AUC为0.785(95%CI:0.663~0.880),TNF-α预测疗效的AUC为0.697(95%CI:0.567~0.807)。结论慢性牙周炎伴Hp感染患者龈沟液SFRP1、TNF-α呈高表达,hBD3呈低表达,并与Hp感染程度有关,检测三者水平可预测临床疗效,应用价值较高。

VEGF165/HBD3双基因共表达真核质粒载体的构建及其体外表达

目的构建人血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)和人β防御素3(humanbeta defensins,HBD3)双基因共表达真核质粒载体、观察其在293FT细胞中的表达,并检测其活性。方法利用RT-PCR方法分别从白血病细胞(HL60)和牙龈组织中扩增出VEGF165和HBD3基因片段,通过DNA重组技术将基因片段先后重组于pVIVO1-mcs真核表达载体上,构建成pVIVO1-VEGF165-HBD3重组质粒载体,分别用酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组质粒载体进行鉴定。运用脂质体转染的方法将重组质粒转染293FT细胞后,RT-PCR和Western blot法检测目的基因的表达。用转染重组质粒的293FT无血清上清刺激内皮细胞EA.hy926增殖,CCK-8法检测其增殖效应。取转染重组质粒的293FT无血清上清的浓缩液,采用K-B纸片扩散法进行抗菌活性实验。结果①酶切电泳分析得到相应的目的片段,大小与理论计算值一致,DNA测序证实目的基因序列正确无突变,成功构建真核表达质粒载体pVIVO1-VEGF165-HBD3。②RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白质2个水平证实:转染重组质粒的293FT细胞高表达VEGF165和HBD3。③转染重组质粒的293FT无血清上清明显促进内皮细胞EA.hy926的增殖,证实了表达分泌出的VEGF165的活性。转染重组质粒的293FT无血清上清的浓缩液对大肠埃希菌(escherichia coli,EC)(ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SA)(ATCC 25923)、绿脓杆菌(pseudomonas aeruginosa,PA)(ATCC 27853)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis,BS)(ATCC62037)产生明显的抑菌环,证实了表达分泌出的HBD3的活性。结论构建了pVIVO1-VEGF165-HBD3双基因共表达真核质粒载体,证实其转染293FT细胞后双基因的表达和活性。

人β防御素3和γ干扰素在MAPK信号通路中的相互诱导及联合抗甲型流感病毒的机制

目的 探讨人β防御素3(HBD3)和γ干扰素(IFN-γ)在丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中相互诱导作用及体外联合抗甲型流感病毒(IAV)H1N1的作用。方法 不同剂量IFN-γ(12.5、25.0、50.0、100.0μg/L)或HBD3(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)分别作用人支气管上皮细胞BEAS-2B 4、12、24、48 h,另设立p38 MAPK、ERK和JNK通路抑制剂预处理后、用IFN-γ(25.0μg/L)或HBD3(1.00 mg/L)处理BEAS-2B细胞4 h, qRT-PCR和ELISA检测HBD3及IFN-γ基因和蛋白表达,Western blot检测p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK蛋白表达;25.0μg/L IFN-γ、1.00 mg/L HBD3、HBD3 siRNA转染及IFN-γ中和抗体(0.50 mg/L)单独或联合作用BEAS-2B细胞、用5×TCID50H1N1感染,qRT-PCR和Western blot检测IAV核蛋白(NP)基因和蛋白的表达情况。结果 在BEAS-2B细胞中,不同剂量的IFN-γ与HBD3可互相诱导表达(P<0.05或P<0.01),且均可诱导p-p38 MAPK、p-ERK和p-JNK的表达上调(P<0.01);p38 MAPK、ERK和JNK通路抑制剂预处理,均明显下调IFN-γ诱导的HBD3表达、及HBD3诱导的IFN-γ表达(P<0.01);IFN-γ和HBD3单独或联合使用均可明显抑制BEAS-2B细胞中H1N1 NP的表达(P<0.05或P<0.01),转染HBD3 siRNA减弱了IFN-γ抑制H1N1 NP表达的作用(P<0.01),IFN-γ中和抗体介入对HBD3抑制H1N1 NP表达的作用无显著影响(P>0.05)。结论 在BEAS-2B细胞中,HBD3和IFN-γ可通过MAPK通路相互诱导表达,且2者联合使用可增强抗IAV H1N1的作用。

人上皮细胞β防御素3基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人β-防御素3的真核表达载体，为今后转染真核细胞，研究β-防御素3基因的功能奠定一定的基础。方法 体外基因合成人β-防御素3的（hBD3）基因片段，并克隆入PcDNA3．l的载体中，经酶切及测序鉴定。结果 构建的真核表达载体经酶切鉴定无突变发生。结论 成功地构建了PcDNA3．1一hBD3真核表达载体。

人β-防御素3的原核表达及生物活性研究

为研究人β-防御素3(hBD3)蛋白的生物活性,本研究将构建的pET-hBD3重组质粒转染大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导表达,检测结果显示在36℃、0.7 mmol/L/IPTG诱导6 h表达量达到峰值。SDS-PAGE检测显示表达的重组蛋白约26 ku,通过抑菌试验检测,hBD3蛋白对革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌均有抑菌作用,其中对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抑菌作用更明显。本实验为进一步研究hBD3的作用奠定基础。

人β-防御素3在体外对小鼠淋巴细胞增殖反应的影响

为了更充分地阐明人β-防御素3(HBD3)对淋巴细胞增殖反应的影响,试验先用CCK-8对不同浓度的刀豆蛋白A(ConA)诱导的淋巴细胞增殖反应进行检测,进而筛选出最适ConA浓度,然后再用CCK-8检测不同浓度(1,10,100,500,1 000 ng/mL)的HBD3协同最适ConA浓度诱导淋巴细胞增殖反应。结果表明:ConA的最适浓度为2μg/mL;浓度为1,10,100 ng/mL的HBD3可以显著促进2μg/mL ConA诱导的淋巴细胞增殖反应,但是伴随着HBD3浓度的不断升高这一作用逐渐降低,当浓度为500 ng/mL和1 000 ng/mL时表现出一定程度的抑制作用。说明HBD3在一定浓度范围内对ConA诱导的淋巴细胞增殖反应具有促进作用,而超出这一浓度范围就会出现抑制作用。