重组大肠杆菌高效表达hbFGF的培养条件

对工程菌hbFGF/BL2 1(DE3) pLysS高效表达hbFGF的培养条件的研究结果表明 ,接种量 (φ)为 5 % ,当培养液菌体浓度为 0 .8OD6 0 0 时 ,添加 0 .5mmol/L诱导剂IPTG可以获得较高的hbFGF表达量 ,30 %的溶解氧和较低的醋酸浓度有利于hbFGF的表达 .

m-hbFGF在角膜损伤修复中的作用

目的:探讨m-hbFGF在促进角膜损伤修复中的作用。方法:通过角膜穿通伤模型,检测用药后角膜伤口承受压力的极限值。结果:m-hbFGF组110.33±8.43和hbFGF组114.67±9.03均大于对照组75.33±13.66(P<0.05),hbFGF组与m-hbFGF组比较无显著性差异(P>0.05)。结论:m-hbFGF有明确的促进角膜穿通伤伤口愈合的作用。在促进角膜穿通伤伤口愈合的作用方面,m-hbFGF和hbFGF无明显差异。

pcDNA_3-hbFGF转染角朊细胞对真皮成纤维细胞增殖的生物学效应

目的：观察含外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因的角朊细胞（ｈｕｍａｎｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ，ＨＫ），对真皮成纤维细胞（ｈｕｍａｎｄｅｒｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＤＦｉｂ）增殖的影响；探讨转ｈｂＦＧＦ基因ＨＫ对创面愈合的生物学效应及作用机理，为这种转基因ＨＫ细胞用于创面基因治疗的可行性提供实验依据．方法：收集含真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ的ＨＫ细胞培养上清，加入培养的ＨＤＦｉｂ细胞内；ＭＴＴ法测定细胞的增殖率、３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定细胞ＤＮＡ合成率、流式细胞仪分析细胞增殖周期．结果：加入转基因ＨＫ细胞培养上清的ＨＤＦｉｂ细胞，培养７２ｈ后，较正常对照组、加正常ＨＫ培养上清组、加转染空载体ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ的ＨＫ培养上清组，其细胞增殖分别增加１．０，１．５，３．０倍（Ｐ＜０．０１）；细胞ＤＮＡ合成率分别提高１．６，２．３，３．４倍（Ｐ＜０．０１）；ＨＤＦｉｂ细胞周期分析显示加入转基因ＨＫ细胞培养上清２４ｈ时细胞处于Ｓ期的比例较其余对照组增加明显，至７２ｈ时无差别．结论：转染ｈｂＦＧＦ基因真核表达质粒的ＨＫ细胞可以分泌活性物质促进ＨＤＦｉｂ细胞ＤＮＡ合成及增殖；机理为刺激ＨＤＦｉｂ进?

外源性hbFGF cDNA 导入人角朊细胞及其表达

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后，能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ，并探讨其机理；为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础．方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞，经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞．用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ质粒载体；抗ｈｂＦＧＦ抗体免疫细胞化学法观察转基因角朊细胞内ｈｂＦＧＦ的翻译表达；选择人真皮成纤维细胞为效应细胞，应用抗体中和法分析转基因角朊细胞分泌ｈｂＦＧＦ活性物质所引起的成纤维细胞增殖效应，了解ｈｂＦＧＦ向胞外分泌情况．结果：ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ可经脂质体介导有效地转入靶细胞角朊细胞内；用Ｇ４１８筛选纯化转基因后的角朊细胞内含转入的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ，胞浆内有阳性ｈｂＦＧＦ表达，并向胞外分泌ｈｂＦＧＦ活性物质，刺激真皮成纤维细胞增殖．结论：含外源性ｈｂＦＧＦ基因的角朊细胞可于体外纯化及扩大培养。

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。

应用计算机软件辅助重组hbFGF基因的筛选

目的:尝试通过计算机的辅助筛选基因重组组合,期望能减少人工筛选的工作量并得到高表达的蛋白。方法:从影响表达的两个因素即翻译起始区TIR的二级结构自由能和翻译起始区的密码子偏好性问题研究入手,对部分核苷酸进行了突变,利用RNA二级结构预测软件DNASISv2.5对hbFGF的TIR区起始密码子开始前35个核苷酸进行了分析,筛选出预期表达量高的组合并在实验中加以验证。结果:从32种突变方式中筛选出10条自由能绝对值最低的序列做引物,克隆至表达载体上,得到了两株高表达菌株。结论:利用计算机辅助设计可以优化和筛选实验结果,提高工作效率,降低具体实验的工作量。

转基因大豆毛状根hbFGF的检测

目的通过检测转基因大豆毛状根的hbFGF,为利用毛状根生产药物实现工业化提供实验基础。方法采用PCR、RT-PCR、SDS-PAGE电泳、Westem blot印迹、质谱检测等方法,利用植物基因组DNA提取试剂盒,兔抗人bFGF单克隆抗体进行对转基因大豆毛状根hbFGF检测。结果用PCR检测转基因大豆毛状根,并在60条Hyg抗性大豆毛状根中鉴定出19条大豆毛状根整合了hbFGF,阳性率为32%。半定量RT-PCR检测总RNA,表明RNA完整性好,降解较少。SDS-PAGE大致确定重组蛋白的分子量和浓度,分子量约18KDa,hbFGF含量可达110mg/L。兔抗人bFGF单克隆抗体检测表明,hbFGF在转基因大豆毛状根中稳定表达。结论表明转基因大豆毛状根能够稳定表达hbFGF基因,在工业生产中具有广阔的前景。

使用一种新策略在大肠杆菌中高效表达hbFGF(英文)

翻译起始区 (TIR)的二级结构是影响翻译效率的决定性因素 ,同时密码子的偏好性问题也是个至关重要的方面。基于以上两点考虑 ,对hbFGF 5’末端 35个碱基进行了改造 ,对其中 4个位点进行了定点突变 ,另有 4个位点进行了随机点突变。这些突变都可能造成TIR二级结构变化。这 4个随机突变共有 32种组合 ,使用RNA结构预测软件DNASISv2 .5对这 32种序列分别模拟其二级结构且计算其自由能 ,并选取了 10条自由能最高的序列。根据这10条序列 ,分别设计引物引入突变 ,克隆至表达载体pET 3c上 ,然后转化宿主菌E .coli,通过诱导表达纯化及生物测活等常规实验方法 ,最后确定有两株为高表达菌株 ,从某种程度上证明了用计算机辅助设计定点突变的方法来优化外源基因在E .coli中的表达是有效且很有潜力的。

重组人融合基因Nm23-H1/HbFGF的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

根据Nm2 3 H1与HbFGFcDNA序列 ,人工合成一段中间核酸序列 ,将它分别与Nm2 3 H1cDNA的上游引物及HbFGFcDNA的下游引物组成两对引物 ,通过PCR(聚合酶链式反应 )构建出融合基因Nm2 3 H1/HbFGF ,将其定向克隆于质粒载体 pBV2 2 0上 ,经诱导 ,SDS PAGE分析 ,表达产物分子量为 34kD ,表达量占菌体总蛋白的14% ,表达产物以包涵体形式存在 ,ELISA和Western印迹表明包涵体具有Nm2 3 H1和HbFGF抗原性 ,然后对包涵体进行变性、复性及纯化处理 ,取纯化产物进行定性和生物活性分析 ,结果证明纯化产物具有Nm2 3 H1和HbFGF的抗原性及生物活性。以上实验为今后进一步研究融合基因Nm2 3 H1/HbFGF在真核细胞中的抑癌、致癌性质打下了基础。

原核表达hbFGF结构与功能优化的研究

野生型hbFGF蛋白可溶性与稳定性较低一直是困扰研发人员的难题。分析其氨基酸序列发现含有 4个游离巯基 ,其中第 78、96、1 0 1位半胱氨酸游离巯基可能直接影响其可溶性、稳定性及活性。对天然hbFGF进行定点突变 ,一组将Cys78、Cys96同时突变 ,另一组将Cys78、Cys96与Cys1 0 1进行联合突变 ,均改为丝氨酸密码子 ,然后克隆入原核表达载体pET 3c ,进行表达 ,结果发现两种突变蛋白的可溶性大幅度增加 ,稳定性明显上升 ,其中三点突变的效果更为显著 ,但蛋白质的活性明显下降。可以认为 78、96与 1 0 1位半胱氨酸的游离巯基同时参与了天然hbFGF多聚体的形成 ,是导致野生型hbFGF可溶性与稳定性较低的主要原因 ,Cys1 0

PCR——四步两段扩增法分离人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因

引物是决定 PCR 结果的关键。本实验中,引物Ⅰ、Ⅱ虽有26个碱基,但由于其5’端有8个碱基为限制性内切酶的识别序列。所以实际上只有18个碱基与原始模板互补配对。采用标准的 PCR 方法时不能产生理想结果。经采用 PCR——四步两段扩增法从人胎盘cDNA 文库中分离得到—484bp 的 DNA 片段。通过斑点杂交鉴定,结果表明该 DNA 片段为 hbFGF 基因。

农杆菌介导法将hbFGF基因导入大豆的研究

本研究将hbFGF基因克隆到质粒pCambia1301载体,利用基因重组技术在大豆毛状根中表达。以大豆品种吉农13的子叶节和胚轴为外植体,通过发根农杆菌C58C1介导进行转化。得到的毛状根,通过潮霉素抗性筛选,经PCR检测和Western blot印迹分析,结果表明:阳性毛状根中整合并表达了hbFGF基因。

TIR突变的hbFGF在原核系统中高效的表达

目的:为获得非融合高表达hbFGF的大肠杆菌表达系统;方法:设计PCR引物,将hbFGF的5'端前10个密码子突变,优选大肠杆菌较偏好的密码子并降低G+C含量,通过双酶切法将突变后的hbFGF克隆入pBV220质粒载体中,筛选出重组子,再通过温控法对重组菌体进行诱导,分析表达情况,并进一步纯化和测活;结果:bFGF在该系统中高水平表达,表达量超过30%,其中绝大部分形成包涵体,经过包涵体变复性等纯化步骤后测活性,证明有生物活性;结论:TIR区域的基因突变对hbFGF在pBV220中高效表达起到关键作用.

超声清创机联合hbFGF治疗慢性创面临床应用

目的:探讨超声清创机联合人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)在治疗慢性创面中的应用效果。方法:将80例慢性创面患者随机分为实验治疗组和常规换药组,实验治疗组采用第三军医大学野战外科研究所研制的UWI-Ⅱ型超声清创机联合人碱性成纤维细胞生长因子治疗慢性创面,比较两组患者总住院时间、细菌清创率、创面缩小程度。结果:实验治疗组患者的总住院时间、细菌清创率、创面缩小程度均优于常规换药组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:应用超声清创机联合人碱性成纤维细胞生长因子在治疗慢性创面能彻底清除创面坏死组织,减少感染,促进创面愈合,缩短住院时间,减轻患者痛苦。

DT_(389)-hbFGF免疫毒素的克隆与表达(英文)

目的:构建含有白喉毒素氨基端389个氨基酸的片断(DT389)人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)的融合蛋白(DT389-hbFGF)表达质粒并表达该免疫毒素,为阻止白内障术后囊膜混浊寻找物质基础。方法:提取灭活的白喉杆菌DNA和12wk胎脑皮质RNA,应用PCR技术分别扩增出编码DT389的基因片段及编码18kDahbFGF的基因全序列,将两基因先后插入表达载体中,构建含有DT389-hbFGF融合基因的表达质粒,测序后,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,纯化并鉴定表达产物。结果:扩增后得到DT389基因片段及hbFGF全基因序列;构建了DT389-hbFGF融合基因的原核表达载体并成功表达。结论:DT389-hbFGF免疫毒素克隆表达的成功为药物抑制后发性白内障的研究奠定了物质基础。

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒，为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础．方法：含ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增；提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒；经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ；限制性酶切ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ片段，连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内，克隆出真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ．结果：提取及纯化的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒含有大小正确的ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ碱基片段，其碱基序列为编码目的基因的正确序列；凝胶电泳结果证明已将此片段正确地克隆到ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ内．结论：成功地构建了ｈｂＦＧＦ基因的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ．

人碱性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的融合表达

将人碱性成纤维细胞生长因子ｈｂＦＧＦ基因克隆于质粒ｐＧＥＸ，构建了融合蛋白ＧＳＴ－ＦＧＦ的表达质粒ｐＧＥＸ－ＦＧＦ，将ｐＧＥＸ－ＦＧＦ转化大肠杆菌ＤＨ５α，诱导培养后测得融合蛋白表达量占菌体总蛋白量的２２％，每升发酵液中可产生１８８ｍｇＧＳＴ－ＦＧＦ。纯化后的ＧＳＴ－ＦＧＦ用ＥＬＩＳＡ方法检测，证明它有ＦＧＦ的抗原性，以鼠ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３测得它具有ｂＦＧＦ的促细胞分裂活性。

人碱性成纤维细胞生长因子基因在大肠杆菌中的克隆与表达

应用DNA重组技术将编码人碱性成纤维细胞生长因子（bbFGF）的基因克隆至原核高效表达质粒pBV_(221)的启动子下游。SDS-SAGE、ELISA和NTT活性监测结果表明:该重组质粒pBV-hbFGF在大肠杆菌DH5α中,经42℃诱导后,可表达出有较高生物活性的hbFGF。

大肠杆菌可溶性表达人碱性成纤维细胞生长因子的研究

包涵体的形成与外源基因在大肠杆菌中的表达量高度相关 ,在适当的范围内 ,降低hbFGF在表达宿主BL2 1 (DE3)plysS中的表达 ,成为实现高可溶性表达的关键。在不改变氨基酸序列的条件下 ,对hbFGF高表达菌株突变重组子起始密码ATG下游前 3个密码子的摇摆碱基进行随机回复突变 ,共有 7种组合 ,合成引物PCR扩增后 ,克隆至表达载体pET 3c ,将重组子转导BL2 1 (DE3)plysS后 ,IPTG诱导表达 ,发现其中 1株有较高可溶性和活性的菌株。可见部分降低外源蛋白的表达量可以避免与减少包涵体的形成。

大肠杆菌分泌型载体表达重组人碱性成纤维细胞生长因子

设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白（Ｏｍ ｐＡ）信号肽序列的重组分泌型表达载体ｐＳＥ－ｈｂＦＧＦ，在大肠杆菌ＤＨ５α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子（ｒｈｂＦＧＦ）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细菌细胞周质和培养基中。分泌到周质中的ｒｈｂＦＧＦ可占周质总蛋白的１５％ 。