重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞因子分泌的影响

目的研究重组HBHA蛋白对肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌细胞因子的影响。方法原核表达并纯化重组HBHA,N端缺失HBHA(HBHA-ΔN)、C端缺失HBHA(HBHA-ΔC)三种蛋白,用以刺激A549细胞,并设置阴性对照,观察A549细胞分泌细胞因子的情况。结果 rHBHA蛋白可以显著提高A549细胞分泌IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ的水平,而HBHA-△N和HB-HA-△C蛋白对A549细胞分泌IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ和IL-10的作用无显著影响。结论 rHBHA能够促进IL-1β,IL-6,TNF-α,INF-γ分泌,N端和C端缺失后促进作用减弱。提示HBHA在诱导自然免疫以及抵抗结核菌感染中具有重要作用。

胞内分枝杆菌HBHA基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆胞内分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因,并对其进行生物信息学分析和原核表达。【方法】应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对其基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET32a-HBHA,并进行诱导表达。【结果】胞内分枝杆菌HBHA基因完整的ORF全长618bp,编码205个氨基酸,该基因氨基酸序列与M.avium ATCC 25291有较高的相似性。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建了pET32a-HBHA原核表达载体,其可在原核表达系统中诱导表达大小约为38ku的HBHA重组蛋白。【结论】胞内分枝杆菌HBHA是一种抗原指数较高的碱性、亲水性蛋白,可在原核表达系统中被表达。

表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗作用

评价表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌用于结核分枝杆菌感染小鼠的免疫治疗效果。结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠4周后,用表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫治疗,检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。重组耻垢分枝杆菌可有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量,减轻病理损伤。但在降低肺部荷菌量方面不如化疗药物。表达HBHA和hIL12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖,可能成为联合化疗药物控制结核病的有效候选疫苗。

结核分枝杆菌天然黏附素HBHA的制备及其检测应用

目的探讨HBHA在ELISA检测结核病方面的应用。方法将BCG培养至稳定生长期将其苏通培养基上清通过CL-6B层折柱．利用含NaCL的PBS溶液梯度洗脱得到天然HBHA．然后以纯化的天然HBHA蛋白和原核表达的HBHA蛋白为包被抗原分别对肺结核组、肺外结核组、PPD阳性和PPD阴性健康对照组血清各47例进行ELISA检测抗HBHA抗体水平。结果在进行梯度洗脱时含有375mMNaCL的PBS洗脱液可以获得较纯的天然HBHA蛋白。ELISA检测结果表明肺结核组和肺外结核组的血清抗体水平高于PPD阳性和PPD阴性健康对照组（x^2=36．48，P〈0．01），肺结核组和肺外结核组之间（x^2=0.27。P〉0．05）、PPD阳性和PPD阴性健康对照组之间（x^2=0．30，P〉0.05）血清抗体水平没有显著差异。结论利用天然HBHA蛋白和重组HBHA蛋白进行ELISA结核病诊断都具有较高的特异性和敏感性，可以较好地用于结核病的诊断。以天然HBHA为基础的血清学诊断方法具有更好的敏感性和特异性。

HBHA截短体蛋白的表达纯化及其诊断活性研究

目的原核表达HBHAΔC及HBHAΔN蛋白,比较HBHA系列蛋白活性。为进一步研究HBHA临床诊断价值提供实验依据。方法克隆HBHAΔC和HBHAΔN目的基因,用于大肠杆菌(E.coli)BL-21系统表达纯化。将蛋白通过CL-6B柱检测肝素结合能力。并加入到培养BCG的7H9液体培养基中,观察其诱导BCG聚集情况。结果nHBHA,rHBHA及HBHAΔN蛋白均具有肝素结合能力。nHBHA、rHBHA和HBHAΔC蛋白具备诱导BCG聚集的作用。结论成功获得HBHA截短体蛋白;证实HBHA蛋白碳端参与肝素结合功能;蛋白氮端参与诱导BCG聚集反应。该实验结果为进一步研究TB感染分子机制及临床诊断应用奠定基础。

结核分枝杆菌黏附素(HBHA)对小鼠结核病免疫治疗作用的实验研究

目的探讨结核分枝杆菌粘附素(HBHA)对小鼠结核病实验模型的免疫治疗作用。方法取在改良罗氏培养基上生长良好的结核分枝杆菌H37Rv两周培养物,制备成均匀菌悬液,每只小鼠尾静脉注射菌量为106 CFU。于感染2周后,分别对CPG组30 ug、HBHA组5 ug、CpG+HBHA组(CpG 30 ug和HBHA 5 ug)及对照组腹腔注射生理盐水。于感染后4周脱颈处死小鼠,称取小鼠体重、肺脏和脾脏重量,对肺和脾组织进行菌落计数,观察肺病理改变。结果各实验组肺组织的重量与体重和对照组相比稍有偏大,菌落计数中发现HBHA免疫治疗组明显优于空白对照组,在病理切片中对照组小鼠肺组织有大片肉芽肿形成,病理损害严重。其它各组肺部病变呈弥散分布,但病变程度明显轻于对照组,在抗酸染色中空白对照组有大量的抗酸杆菌存在,其它各组相对明显减少。结论实验结果表明HBHA对治疗小鼠结核病变模型起一定的作用。

结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

目的克隆肝素结合血凝素(HBHA)基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pQE80L并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果克隆了HBHA基因,并对其在E.coli中进行了表达,SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法得到28 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结论成功获得了纯化的HBHA蛋白,为进一步研究HBHA蛋白的致病机理提供了实验依据。

结核分枝杆菌抗原HBHA在耻垢分枝杆菌中的重组表达和鉴定

目的构建高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合血凝素(HBHA)的重组耻垢分枝杆菌。方法针对结核分枝杆菌H37Rv株HBHA的编码基因Rv0475设计特异引物,利用PCR技术从细菌基因组中获取目的基因,并克隆入pET-30b(+)载体构建重组原核表达质粒pETHBHA,经IPTG诱导pETHBHA转化的重组E.coli BL21(DE3)细菌,Ni柱纯化携带C-端His标签的HBHA蛋白,并制备鼠源多克隆抗体。PCR扩增含自身启动子和调节序列的Rv0475基因并克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组分枝杆菌表达质粒pMVHBHA,并经酶切鉴定证实后,电转化入耻垢分枝杆菌,涂布含卡那霉素的7H11平板,挑选抗性克隆并扩大培养,15%SDS-PAGE和Western blot鉴定重组耻垢分枝杆菌的表达。结果分别成功构建重组原核表达质粒pETHBHA和重组分枝杆菌表达质粒pMVHBHA;重组蛋白HBHA在大肠埃希菌中成功表达并纯化后,BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度为1.912 5μg/μL,用其制备鼠源多抗;证实HBHA利用其自身的启动子和调节序列在重组耻垢分枝杆菌中表达。结论成功构建过表达HBHA的重组耻垢分枝杆菌,为研究该蛋白参与结核病的致病机制和研发新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。

牛分支杆菌HBHA基因的克隆及原核表达

应用PCR技术扩增牛分支杆菌肝素结合血凝素(HBHA)基因并原核表达牛分支杆菌HBHA基因,利用在线分析软件对该基因序列及编码蛋白序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体pET28a(+)-HBHA,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经0.6mmol/L IPTG诱导目的蛋白表达,采用镍离子亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot检测表达结果。结果表明,牛分支杆菌HBHA基因完整的ORF全长600bp,编码199个氨基酸。HBHA蛋白为碱性、亲水性蛋白质,含有12个潜在的磷酸化位点,存在抗原表位,亚细胞定位主要存在于细胞核及线粒体中,蛋白空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HBHA并在大肠埃希菌中得到了高效表达,分子质量大小为28ku,主要以可溶性形式存在。说明牛分支杆菌HBHA蛋白是一种抗原指数较高的亲水性蛋白,在原核系统能高效的表达,为进一步研究提供了理论基础。

结核分枝杆菌黏附素HBHA在结核病免疫学诊断中的应用

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素（Heparin—binding haemagglutinin adhesin，HBHA）在结核病免疫诊断方面的应用价值。方法将在苏通培养基中培养至稳定期的卡介苗菌株（BCG）菌体超声裂解，离心后取上清并通过CL-6B层析柱，利用含0—500mmol／L氯化钠的磷酸盐缓冲溶液（PBS）进行梯度洗脱后获得天然HBHA。以BCG基因组为模板PCR扩增结核分枝杆菌hbha基因片段，质粒pET-32a为载体，大肠杆菌作为宿主菌制备原核表达的HBHA重组蛋白。以纯化的天然HBHA蛋白和原核表达的HBHA蛋白为包被抗原，分别对肺结核组、肺外结核组、PPD阳性和PPD阴性健康对照组各47例血清通过ELISA方法检测抗HBHA的抗体水平。应用SPSS11．5统计软件对各研究组数据进行方差齐性检验，然后进行t检验，并计算各研究组的敏感度和特异度。结果含有375mmol／L氯化钠的PBS洗脱液可以洗脱获得较纯的天然HBHA蛋白。利用重组HBHA所带的组氨酸标签进行特异分离、纯化。ELISA检测结果表明天然HBHA蛋白和重组HBHA蛋白、PPD阳性和PPD阴性健康对照组之间血清抗体水平差异不明显。肺结核组与肺外结核组的血清抗体ELISA检测的吸光度值在散点图中分布有明显差异，肺结核组吸光度值集中分布在0．30—0．40之间，肺外结核组吸光度值分布在0．35—0．45之间，经统计学检验结果差异具有统计学意义（t：12．224，P〈0．05）。结核组（肺结核和肺外结核）与对照组（PPD阴性，PPD阳性）吸光度值分布具有显著不同，对照组全部小于0．30，结核组吸光度值则集中分布于0．30—0．45之间。经统计学检验（t=25．909，P〈0．05）血清抗体水平具有显著性差异。结论结核分枝杆菌黏附素HBHA在结核病免疫学诊断的应用中具有较好的特异度和敏感度，有望用于结核病、尤其是肺外结核病的实验室辅助诊断。

HBHA在结核病研究中的应用

结核分枝杆菌hbhA编码基因是目前发现的与肺外结核转移相关的基因,其表达产物结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素(HBHA),是结核分枝杆菌表面表达和分泌的一种糖蛋白。HBHA具有介导肺结核和肺外结核的发生,参与实现MTB逃逸吞噬体进入细胞质中生存和繁殖,引起巨噬细胞凋亡等重要生物学功能,同时HBHA作为特异性抗原,用作免疫学检测具有较好的效果,并且动物实验证实HBHA具有明确的免疫治疗作用。因此,HBHA在结核病的免疫学诊断及免疫治疗方面,具有广阔的应用前景。

牛分枝杆菌HBHA-HSP65融合黏附素蛋白对小鼠的免疫保护力

本研究以牛分枝杆菌valleeⅢ菌株的基因组DNA为模板,PCR扩增hbha和hsp65基因,采用重叠延伸剪接技术(SOE)获得融合基因hbha-hsp65,构建重组表达质粒p ET-hsp65、p ET-hbha、p ET-hsp65-hbha,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达蛋白纯化后与等体积的弗氏不完全佐剂混合,制备成浓度为150 g/m L的HBHA-HSP65亚单位疫苗。用其免疫BALB/c小鼠,评价其免疫保护效力。结果显示,表达蛋白的分子质量分别为65、28、95 ku,主要以可溶状态存在;ELISA测定的HBHA-HSP65的血清抗体效价达1∶16 000,显著高于HBHA、HSP 65和BCG组(P<0.05);经MTT法测定,平均刺激指数为2.45,HBHA-HSP65组显著高于HSP65(P<0.05)、HBHA和BCG免疫组(P<0.01)和PBS(P<0.01);HBHA-HSP65的脾、肺荷菌量检测结果显示,该亚单位疫苗可明显降低牛分枝杆菌在小鼠脾的荷菌量(P<0.05),几乎完全切断对肺的感染(P<0.01)。结果表明,HBHA-HSP65亚单位疫苗能够在小鼠体内激发细胞免疫和体液免疫应答,对牛分枝杆菌感染小鼠有一定的预防保护效果,具有良好的免疫原性。

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。

结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎诊断、鉴别诊断的临床观察

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎诊断、鉴别诊断的价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例为观察组,另选取恶性肿瘤胸膜转移患者40例为对照组,以重组结核分枝杆菌肝素结合血凝素为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体。结果观察组IgG抗体高于对照组,差异有显著性(P<0.05);ROC曲线分析结果显示,胸水中IgG抗体的诊断临界值为0.46时,诊断敏感度为90.7%、特异度为90.0%、准确度为90.4%。结论结核分枝杆菌肝素结合血凝素对结核性胸膜炎的辅助诊断,以及与恶性肿瘤胸膜转移的鉴别诊断具有重要价值。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素(heparin-binding hemagglutinin adhesin,HBHA)、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象,以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0.630,0.430,0.470;恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0.340,0.248,0.271,结核组高于恶性胸腔积液组,差异有统计学意义(P<0.001);ROC曲线分析结果显示,胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0.46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90.7%、特异度为90.0%、准确度为90.4%。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论 HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值,优于MPT64及38kD蛋白。

重组结核分枝杆菌黏附素、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值比较

目的探讨重组结核分枝杆菌黏附素（heparin-bindinghemagglutininadhesin，HBHA）、MPT64、38kD蛋白在结核性胸膜炎中的诊断价值。方法选取结核性胸腔积液患者54例、恶性胸腔积液患者40为研究对象，以HBHA、MPT64、38kD蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测患者胸腔积液中IgG抗体滴度。结果结核性胸腔积液组3种抗原对应的IgG抗体吸光度均数分别为0．630，0．430，0．470，恶性胸腔积液组3种抗原对应抗体吸光度均数分别为0．340，0．248，0．271，结核组高于恶性胸腔积液组，差异有统计学意义（P〈0．001）；ROC曲线分析结果显示，胸水中HBHA抗体的诊断临界值定为0．46时用于鉴别诊断结核性胸膜炎和癌性胸水的敏感度为90．7％、特异度为90．0％、准确度为90．4％。诊断准确度高于MPT64及38kD蛋白。结论HBHA蛋白抗体对于结核性胸膜炎与癌性胸水的鉴别诊断具有重要价值，优于MPT64及38kD蛋白。

肝素结合血凝素通过抑制A549细胞的自噬作用增强耻垢分枝杆菌的感染能力

目的将肝素结合血凝素(HBHA)重组表达于耻垢分枝杆菌(MS),鉴定其对A549细胞自噬作用的影响。方法将HBHA克隆于穿梭表达质粒pMV261,构建HBHA重组载体,电转化至MS;感染A549细胞,Western blot法鉴定A549细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)的表达情况,并检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化可估计自噬的水平;利用单丹磺酰尸胺(MDC)将自噬体染色后,激光共聚焦观察细胞内自噬体变化的情况;通过MS、rMS-HBHA感染A549细胞18 h,计算胞内活菌数,鉴定感染状况。结果 rMS-HBHA经42℃热诱导成功表达HBHA蛋白;相对野生型MS,重组表达HBHA蛋白的MS(rMS-HBHA)可以显著抑制A549细胞中的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的表达,rMS-HBHA组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值为0.625显著低于MS组2.025,表明rMS-HBHA组自噬体形成受到抑制;并且rMS-HBHA感染A549细胞18 h后胞内活菌为6.3×106,明显高于MS组1×105。结论外源性HBHA可以通过抑制A549细胞的自噬作用增强MS的感染能力。

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素与结核病

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素是一种表面蛋白，有3个功能结构域，其C末端在翻译后进行甲基化修饰，与其免疫特性相关。可结合硫酸化糖，可通过补体C3介导与巨噬细胞的结合，与上皮细胞结合在肺外结核发病中有重要作用。通过对其细胞免疫及体液免疫作用的研究发现，其在诊断中有较好的作用，在免疫预防及免疫治疗中有广阔的应用前景。

结核分枝杆菌肝素结合血凝素蛋白的表达、纯化及免疫学特性的初步研究

目的:克隆肝素结合血凝素(HBHA)基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化,利用获得的蛋白进行免疫学特性的初步研究。方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段,克隆至pMD18-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pQE80L并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。获得的蛋白免疫BALB/c小鼠,测定血清抗体水平及IgG2a/IgG1比例。结果:克隆了HBHA基因,并成功表达该蛋白,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确。通过亲和层析法得到28kD纯化蛋白,与文献报道相符,诱导小鼠可使CD4+和CD8+细胞数明显增加。结论:成功获得了纯化的HBHA蛋白,明确了HBHA蛋白的免疫学特性,为进一步研究HBHA蛋白的致病机理及新型疫苗的开发提供了实验依据。

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素的原核表达及其在结核病血清学诊断中的应用

目的原核表达与纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)肝素结合血凝黏附素(heparin-binding haemagglutinin adhesion,HBHA),并初步评估其在结核病血清学诊断中的价值。方法采用PCR法从M.tb H37Rv基因组中扩增hbha基因,克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28ah,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组HBHA(r HBHA)蛋白经Ni2+亲和层析柱纯化后,Western blot法分析其抗原特异性。收集71例确诊的结核病患者和30名健康体检者血清,采用ELISA法检测血清中的抗HBHA Ig A、Ig G抗体水平,并以ESAT-6、Ag85A作为对照抗原,评估r HBHA在结核病血清学诊断中的价值。结果重组表达质粒p ET-28ah经酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,经Ni2+亲和层析柱纯化,可得到高纯度的r HBHA蛋白;纯化的r HBHA蛋白可与小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性结合;结核病患者(TB)组血清中抗r HBHA、ESAT-6、Ag85A抗原特异性Ig G水平均显著高于健康对照(HC)组(P<0.05),且TB组的r HBHA抗原特异性Ig A水平也显著高于HC组(P<0.05),而两组间ESAT-6、Ag85A抗原特异性Ig A水平差异无统计学意义(P>0.05);ROC曲线分析显示,r HBHA抗原检测Ig A的诊断效能较好,曲线下面积为0.711,其他两种对照抗原ESAT-6、Ag85A的Ig A诊断效能一般,曲线下面积分别为0.512和0.531。结论 r HBHA抗原用于结核病的诊断效能较好,可作为结核病血清学诊断的备选抗原之一。