构建外源性重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体转染兔骨髓基质干细胞(英文)

背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚。目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力。设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成。材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意。健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供。方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组。转染前1d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染。主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况。结果:转染72h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性。pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01)。结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。

hBMP-7基因直接体内转染修复兔桡骨缺损实验研究

目的 探讨含人骨形态发生蛋白 7(hBMP - 7)基因逆转录病毒液与左旋聚丙交酯 (PLLA)生物材料复合后修复兔桡骨缺损的效果。方法 制备含hBMP - 7真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT -PLNCX2 -BMP7。制备新西兰大白兔桡骨 1 5cm缺损模型 ,修复实验分为 4组 :PT -PLNCX2 -BMP7+PLLA修复组 ,空载体 (PT -PLNCX2 ) +PLLA修复组 ,单纯PLLA生物材料修复组 ,空白组。每组 6个样本。分别于术后 8、12、16周进行大体观察、X线检测和组织学检测。结果 PT -PLNCX2 -BMP7重组病毒液与生物材料复合修复组可见在骨缺损处有骨性连接形成 ,组织学观察见有大量新生骨组织形成 ,而PT -PLNCX2 病毒液修复组、单纯材料修复组和未修复组均未见骨性连接形成 ,仅在部分骨缺损两断段形成少量骨组织。结论 利用hBMP - 7基因体内局部。

重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究

[目的]构建人骨形态发生蛋白-7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因真核表达载体,评价其转染兔骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的诱导成骨能力。[方法]从人类胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,成功构建了重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体;从兔骨髓中分离培养BMSCs,分为3组:A pcDNA3.1-hBMP-7转染组;B空载体pcDNA3.1转染组;C未转染组。使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在BMSCs中的表达。检测各组细胞碱性磷酸酶,胶原,骨钙蛋白合成情况。[结果]RT-PCR、免疫组织化学检测显示经hBMP-7转染的BMSCs中有BMP-7表达。经hBMP-7转染BMSCs的碱性磷酸酶于转染后第2 d显著增高,到第8 d达到最高;经hBMP-7转染的BMSCs合成胶原、骨钙蛋白能力也显著提高,与转染空载体、未转染的BMSCs相比有显著性差异(P<0.05)。[结论]成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体;外源的hBMP-7基因可在兔BMSCs中充分、高效的表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备了促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力,这为hBMP-7的基因治疗提供了坚实的理论基础。

hBMP-7基因转染修复骨缺损的实验研究

目的探讨利用人骨形态发生蛋白7(hBMP-7)基因转染骨髓基质干细胞(BMSc)构建组织工程化骨组织并修复兔桡骨骨缺损的可行性。方法制备含hBMP-7真核细胞表达载体的逆转录病毒液PT-PLNCX2-hBMP-7并转染BMSc,使用免疫组织化学的方法检测hBMP-7在BMSc中的表达。兔桡骨1.5cm骨缺损修复实验分为4组:转染组,未转染组,单纯PLLA组和对照组,每组6个样本。分别于术后3周,6周采用大体观察、X线、组织学检测、免疫组织化学检测等方法对骨缺损修复情况进行对比。结果免疫组织化学检测显示经PT-PLNCX2-hBMP-7病毒液转染的BMSc中有较强的阳性结果出现。定量检测分析结果证实经转染的BMSc修复骨缺损的成骨速度和成骨量均优于未转染组,单纯PLLA组和对照组中均未见骨缺损得到修复。结论hBMP-7基因转染能够提高BMSc形成组织工程化骨组织和修复骨缺损的能力,可用于以BMSc为种子细胞的组织工程化骨组织的构建。

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体体内诱导成骨及成血管研究

目的探讨hVEGF165及hBMP-7共表达重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体内诱导成骨及成血管的活性,为股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)的AAV基因治疗提供理论基础。方法取体外培养的第3代兔BMSCs,分别采用以下4种病毒转染并分为4组:rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(A组)、rAAV-hVEGF165-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)(B组)、rAAV-hBMP-7-GFP(C组)及rAAV-IRES-GFP(D组)。取24只雄性新西兰大耳白兔制作后肢缺血模型,并随机分为4组(n=6),于股骨肌肉内植入上述4组病毒转染的BMSCs,8周后应用超声影像学检测兔后肢胫前动脉血流量,行CD34免疫组织化学染色检测微血管生成。另取24只雄性新西兰大耳白兔制作股骨肌袋模型,并随机分为4组(n=6),于肌袋内植入上述4组病毒转染的BMSCs,8周后应用X线片检测兔后肢原位骨化,行von Kossa钙盐染色检测肌肉组织成骨矿化。结果病毒注射后动物未出现局部或全身毒性反应。病毒注射后8周,A组兔后肢胫前动脉血流百分比及CD34阳性微血管数均高于其他3组,差异有统计学意义(P<0.05);B组高于C、D组,差异有统计学意义(P<0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。病毒注射后8周,A、C组兔后肢肌袋内出现可被X线检测到的原位骨化,von Kossa肌肉组织钙盐染色可见大量钙盐沉积,且A组原位骨化及钙盐沉积程度均较C组强;B组及D组均未见明显原位骨化及钙盐沉积形成。结论 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7载体具有体内诱导成骨及成血管的生物学活性。

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体介导基因表达的时效性研究

目的探讨hVEGF165及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导基因表达的时效性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。方法应用荧光细胞计数法测定rAAV转染兔BMSCs的最佳转染复数。分别采用rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green?uorescent protein,GFP)标记平行对照rAAV-IRES-GFP(对照组)在最佳转染复数条件下转染体外培养的第3代兔BMSCs。于不同时间点分别行GFP表达检测、RT-PCR检测、Western blot检测明确rAAV体外介导基因表达的时效性关系。将实验组及对照组病毒转染后的BMSCs以5×106个/mL密度,分别注射至9只2月龄纯种雄性新西兰大耳白兔制备的肌袋模型内各1mL(实验组1及对照组1),于不同时间点分别行GFP表达检测、Western blot检测及ELISA检测明确rAAV体内介导基因表达的时效性关系。结果 rAAV转染兔BMSCs的最佳转染复数为5×104v.g/cell。通过体外检测显示rAAV转染BMSCs后1d即有目的基因表达,14d时表达强度明显增强,至28d时仍维持较强表达。通过体内检测显示体内转染2周可检测到目的基因表达,6周时表达强度增强,8周时仍维持较高水平。ELISA法检测实验组1细胞培养上清中hVEGF165和hBMP-7含量分别为(248.67±75.58)pg/mL和(4.80±0.61)ng/mL,对照组1分别为(32.28±8.42)pg/mL和(0.64±0.42)ng/mL,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7具有较好的转染时效性。

hBMP-7基因在脂肪源性干细胞中的表达及对其向成骨细胞分化的影响

目的构建hBMP-7基因真核表达载体,观察其在兔脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的表达,并观察其对ADSCs向成骨细胞分化的影响。方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔,雌雄不限,体重3～4 kg。取兔皮下脂肪约5 mL,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验;CD44、CD49d、CD106免疫荧光染色鉴定ADSCs。构建真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7,经鉴定后利用LipofectamineTM 2000介导转染ADSCs,免疫组织化学染色检测hBMP-7在ADSCs中的表达;ALP定量测定、Ⅰ型胶原免疫荧光检测hBMP-7基因转染对ADSCs向成骨细胞分化的影响。结果倒置相差显微镜观察示ADSCs呈梭形、多角形分布;表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106呈阴性表达。成功构建pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体,并利用脂质体介导的方法成功导入ADSCs中,免疫组织化学染色提示hBMP-7能在ADSCs中表达。ALP定量测定示,转染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7转染组(实验组)ALP活性明显高于pcDNA3.1空载体转染组(对照组),差异有统计意义(P<0.05);转染后7、14 d,实验组Ⅰ型胶原表达量均高于对照组(P<0.05)。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7可在兔ADSCs中表达,且转染后的ADSCs ALP定量测定、成骨标志物Ⅰ型胶原的表达均高于pcDNA3.1空载体转染细胞,为开展以干细胞为载体的局部基因治疗奠定了基础。

hVEGF_(165)及hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体的体外生物学活性研究

目的通过体外实验探讨hVEGF165和hBMP-7共表达重组腺相关病毒载体(recombinant adeno-associated virus,rAAV)体外生物学活性,为体内应用其进行骨坏死的基因治疗奠定理论基础。方法分别采用rAAV-hVEGF165-内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site,IRES)-hBMP-7(实验组)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的rAAV-IRES-GFP(对照组)转染体外培养的第3代兔BMSCs,于转染后1、2、3、7及14d应用ELISA法及转染后14d应用Western blot法鉴定两组hVEGF165和hBMP-7表达;转染后14d行细胞免疫荧光染色观察hVEGF165和hBMP-7表达一致性。应用第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)管状血管形成实验检测hVEGF165蛋白活性。取第3代BMSCs行诱导成骨实验,Gomori钙钴法ALP染色及茜素红法钙盐染色检测hBMP-7蛋白活性。结果ELISA检测示随转染时间延长,两组hVEGF165和hBMP-7表达逐渐升高;实验组各时间点hVEGF165和hBMP-7表达量均明显高于对照组(P<0.05)。Western blot检测示实验组可见hVEGF165和hBMP-7表达,对照组未见阳性表达。细胞免疫荧光染色观察示实验组hVEGF165和hBMP-7染色呈阳性,表达部位和强度具有较好一致性;对照组未见阳性表达。HUVEC管状血管形成实验示实验组HUVEC拉长变形、出芽且相互交联成管状样结构;与对照组相比,管状血管数比较差异有统计学意义(P<0.05)。ALP染色见实验组细胞出现深染颗粒,对照组细胞内浅着色;与对照组相比,矿化结节数比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论双基因共表达rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7体外具有良好的生物学活性。

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。

国人BMP-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的 :证实人牙乳头细胞中 BMP- 7的表达 ,获得 h BMP- 7成熟肽基因。方法 :提取人牙乳头细胞总 RNA,反转录合成 c DNA,以特异性引物扩增 h BMP- 7成熟肽基因并克隆入 T载体 ,筛选阳性克隆进行序列测定。结果 :PCR扩增得到一特异性的约 430 bp的片段 ,克隆后筛选出阳性克隆 ,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致。结论 :人牙乳头细胞中有 BMP- 7基因的表达 ,并克隆得到 h BMP- 7成熟肽基因 ,为 h BMP-

人骨形态发生蛋白-7成熟肽毕赤酵母表达重组子的构建

目的 :构建人骨形态发生蛋白 -7(bonemorphgeneticprotein -7,BMP -7)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达重组子。方法 :以本室保存的重组质粒 pBV220/BMP -7为模板,经PCR扩增出人BMP -7成熟肽编码序列 ,先以A -T连接方式克隆入pGEM -Teasy载体,再将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体 pPIC9中,重组质粒线性化后PEG法转化入毕赤酵母菌株GS115,用PCR方法筛选转化子。结果 :DNA序列分析和PCR鉴定表明成功构建了人骨形成蛋白 -7(BMP -7)毕赤酵母表达重组子。结论 :为今后基因工程大量生产BMP -7打下基础。

人骨形成蛋白7基因转染骨髓间充质干细胞对兔退变椎间盘蛋白多糖的影响

目的:观察腺病毒介导人骨形成蛋白7基因(Human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)转染骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell,BMSC)后移植兔退变椎间盘,对退变椎间盘髓核组织中蛋白多糖含量的影响。方法:20只新西兰大白兔手术建立椎间盘L3/4、L4/5、L5/6退变模型,随机分为两组,每组10只:实验组L3/4、L4/5、L5/6椎间盘内注射腺病毒介导hBMP-7基因转染的BMSC;对照组L3/4、L4/5、L5/6椎间盘注射磷酸盐缓冲液(PBS)。术后连续行磁共振观测椎间盘变化;12周后取材,应用RT-PCR、免疫组化检测hBMP-7的表达情况,分光光度法测量蛋白多糖含量。结果:与对照组相比,实验组的磁共振T2信号强度以及蛋白多糖含量均明显增高(P<0.05)。hBMP-7的mRNA和蛋白水平在实验组中的表达水平也最高。结论:腺病毒介导hBMP-7转染BMSC后,移植退变椎间盘,可使髓核组织中蛋白多糖的含量增加。