基因芯片技术检测HBV HCV及HBV YMDD变异株

目的:探讨基因芯片技术在乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及HBVYMDD变异株检测中的应用.方法:采用HBV、HCV联合基因芯片检测40份血清标本,并与HBV,HCV基因定量检测方法比较;采用HBVYMDD变异株芯片检测20份血清标本,并与错配PCR及DNA序列测定方法比较.结果:HBV,HCV联合基因芯片与HBVDNA定量检测的符合率为85%(34/40),HBV检出率为83%(19/23),假阳性率为12%(2/17);与HCVRNA定量检测的符合率为85%(34/40),HCV检出率为58%(7/12),假阳性率为4%(1/28).HBVYMDD变异株芯片与本室设计的错配PCR符合率为70%(14/20),5份芯片检测的标本与DNA序列测定结果一致,该芯片尚可检测出不同病毒体或变异体的混合感染.结论:HBV,HCV联合基因芯片对HBV的检测有较高的敏感性,但存在一定程度的非特异性;对HCV的检测敏感性偏低,但特异性较高.HBVYMDD变异株芯片敏感性和特异性均较高,同时能检测出病毒变异体的共生现象.

拉米夫定治疗前后YMDD变异与HBV—DNA水平相关性分析

目的：通过对慢性乙型肝炎（CHB）患者血液中HBV—DNA、谷丙转氨酶（ALT）、r-谷氨酰转移酶（r—GT）的检测，了解CHB患者经拉米夫定（3TC）治疗前后HBV—YMDD变异情况，分析HBV—YMDD变异与HBV—DNA、ALT、r—GT相关情况，探讨3TC治疗CHB的效果以寻找最佳治疗方案。方法：对71例治疗前CHB患者，检测HBV—YMDD变异株；选择64例HBV-YMDD的CHB患者经治疗1年后，检测HBV—YMDD变异株；选择36例患者经治疗后仍然是YMDD;13例经治疗后由YMDD变为YIDD；5例治疗后由YMDD变为YVDD的；9例经治疗后由YMDD变异为YMDD＋YVDD混和型的CHB进行检测HBV—DNA、ALT、r—GT含量。结果：71例CHB用3TC治疗前已有7例存在变异现象，其中2例是YVDD型；3例是YIDD型；2例是YMDD＋YVDD混合型；64例治疗前为YMDD型的患者，用3TC治疗后36例没有变异、5例变异为YVDD、13例变异为YIDD、9例变异为YMDD＋YVDD、1例变异为YMDD＋YIDD；36例治疗前后DNA没有变异的CHB，治疗前后的HBV-DNA、ALT、r—GT含量差异有显著意义；13例治疗后由YMDD变为YIDD，治疗前后的HBV—DNA含量差异有显著性，而ALT、r—GT含量在治疗前后差异无显著意义；5例治疗后由YM-DD变为YVDD和9例经治疗后由YMDD变异为YMDD＋YVDD混和型，治疗前后HBV—DNA、ALT、r—GT含量差异无显著意义。结论：CHB用3TC治疗前已经存在着9.85％变异率。64例YMDD用3TC治疗1年后，有43．75％发生变异，变异的类型以YIDD为主。HBV—YMDD没有变异时，经3TC治疗CHB后患者的HBV-DNA、ALT、r—GT含量比治疗前有较大降低，效果明显。YMDD变异为YIDD时，经治疗后患者血液中的HBV-DNA含量比治疗前有较大降低，而血液中ALT、r—GT含量比治疗前降低不大。YMDD变为YVDD时，其血液中的HBV—DNA量高于治疗前，ALT、r-GT含量比治疗前降低不大。YMDD变为YMDD＋YVDD混和型时，经治后CHB患者血液中的HBV—DNA量比治疗前稍高，ALT、r-GT含量比治疗后降低不大。

拉米夫定耐药与HBV YMDD变异关系的研究

探讨拉米夫定耐药与HBVYMDD变异之间关系。对拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎进行肝功能、乙肝病毒血清学指标、YMDD耐药基因变异检测。 10 2例慢性乙型肝炎血清中 ,HBVDNA阴性 6 3例 (6 1 8% ) ,39例阳性 ,其中HBVYMDD变异 2 2例 ,变异率为 5 6 4 % ,并与用药时间长短有关 ,9- 17个月和 18- 30个月变异检出率分别为5 1 7%和 70 % ,HBVYMDD变异组ALT为 (5 9 94± 8 6 0 )U/L ,显著高于无HBVYMDD变异组的 (5 0 6 0± 6 12 )U/L。基因芯片技术检测HBVYMDD变异有一定的临床意义 ,YMDD变异是HBV对拉米夫定耐药的原因之一。

HBV-YMDD变异患者与中医虚实辨证关系初探

目的 :初步探讨服用拉米夫定后HBV -YMDD变异患者中医辨证虚证、实证之间的关系。方法 :对服用拉米夫定半年以上的乙型慢性病毒性肝炎患者采用联合基因集团上海博华基因技术有限公司出品的迈科锐乙型肝炎病毒突变检测基因芯片 ,进行HBV -YMDD变异检测。出现HBV -YMDD者 ,根据中医基础理论 ,将其分为实证、虚证 ,来探讨HBV -YMDD变异患者中医虚、实辨证的关系。结果 :HBV -YMDD变异患者中实证变异率(38/ 4 8)明显高于虚证 (10 / 4 8) ,具有统计学意义。结论 :HBV -YMDD变异与虚、实辨证之间具有相关性。

采用Inno-Lipa HBV DR测定法在非活动性HBV携带者中检测到YMDD变异株

背景：HBV聚合酶突变尤其是出现在高保守性YMDD区域是与拉米夫定耐药性有关的。尽管第二次使用拉米夫定会经常出现这些突变，但也可能是自然发生的突变。本研究目的是测定非活动性HBV携带者中自然发生YMDD变异株的发生率。

HIV/HBV合并感染者经含拉米夫定的HAART治疗后YMDD变异

目的探讨HIV/HBV合并感染者接受含拉米夫定(3TC)的高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)后诱导乙型肝炎病毒YMDD变异的情况和变异影响因素,从而为合并感染者的治疗提供研究基础.方法采用Singer法DNA直接测序法对64例HIV/HBV合并感者HBV YMDD序列进行检测.结果 20例HIV/HBV合并感染者血清标本中,检测出存在HBV YMDD变异8例,检出率40%,其中YIDD 2例(25%),YVDD 6例(75%),且均伴rt L180M位点变异.在YMDD变异株中发现其他几个高频变异位点:rt Y221F,rt T222A,rt V224I,rt N238H,rt I269L等.YI/VDD+L180M变异中有7例同时伴随Y221F+V224I+N238+I269L变异,检出率87.5%.在HIV/HBV合并感染者中,YMDD变异组的抗病毒治疗时间显著长于未变异组(P<0.05),而在患者的社会人口学特征、HIV感染的途径和时间、抗病毒治疗前的肝功(ALT、AST)和免疫状态(CD4、CD8)、是否合并HCV感染、当前HBV-DNA含量以及最近1次随访的肝功和CD4、CD8细胞学计数中2组差异无统计学意义(P>0.05).结论在HIV/HBV合并感染者中,HBV YMDD的变异率发生较高,变异的类型较为复杂.YMDD变异随含3TC的HAART治疗时间的延长,耐药的发生率增高,因此动态监测YMDD变异情况,有助于治疗过程中及时发现变异情况,以调整治疗方案.YMDD变异对疾病的影响尚不清楚,对于发生YMDD变异的患者应密切观察其肝功能变化,及时加强保肝治疗.

未经拉米夫定治疗HBVYMDD变异的临床分析

目的分析未经拉米夫定治疗的HBV病毒YMDD变异出现的情况,探讨HBV病毒YMDD变异出现可能的机理,了解以YMDD自然变异的慢性HBV感染患者的肝损害情况。方法对140例HBVDNA阳性,未经拉米夫定治疗的慢性HBV感染者进行YMDD检测,同时检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血清总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)、发病年龄、HBeAg与抗HBe等临床相关指标。结果140例未经拉米夫定治疗的慢性乙肝病毒感染者中20例自然发生YMDD变异,YMDD变异组与未变异组引起的肝损害无显著性差异(P>0.05)。YMDD变异与HBeAg与抗HBe的阳性表达无明显差异(P>0.05)。结论HBV病毒YMDD变异株作为一个准种与野毒株同时存在感染个体,YMDD变异对肝损害严重性无关,YMDD变异与HBeAg阳性率与抗HBe阳性率无明显差异。

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎过程中HBV发生YMDD变异的检测

目的建立乙型肝炎病毒Ｐ基因区ＹＭＤＤ变异的检测方法，对用拉米夫定治疗５２周出现耐药的病人进行检测。方法从８８例治疗病人中选择１０例服用该药后ＨＢＶＤＮＡ转阴（＜１．６ｐｇ／ｍｌ），５２周时又反跳≥２０ｐｇ／ｍｌ的病人，用 ＰＣＲ后直接测序的方法，分别对 ０周和 ５２周标本进行 ＨＢＶ ＤＮＡ聚合酶活性区域的测序。结果 １０例服药５２周后ＨＢＶ ＤＮＡ反跳病人中７例测得ＨＢＶ ＹＭＤＤ变异。其变异分为两种类型：第一种类型为ＹＶＤＤ有５例，有核苷酸Ａ７４１→Ｇ，均伴有Ａ６６９→Ｃ的变异。第二种类型为ＹＩＤＤ有２例，有核苷酸Ｇ７４３→Ｔ，其中１例还有Ｔ７８１→Ｃ。结论少数病人在拉米夫定治疗过程中出现耐药，可能和ＨＢＶ ＹＭＤＤ变异有关。

拉米夫定治疗中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和变异株的变化

目的 观察慢性乙型病毒性肝炎 (CHB)患者应用拉米夫定治疗前后 ,YMDD野毒株及变异株的动态变化 ,并分析其临床意义。方法 取 5例CHB患者治疗前与治疗 48周的 10份血清标本 ,先用PCR法扩增包括YMDD基序的乙型肝炎病毒 (HBV )部分核苷酸序列 ,然后进行DNA序列测定 ,同时分别进行克隆 ,每份标本随机挑选 2 0～ 2 4株单克隆 ,用实时荧光PCR法检测YMDD野毒株及其变异株。结果 5例CHB患者治疗前PCR产物直接测序结果未检出YMDD变异 ,治疗 48周时有 4例检出YMDD变异 ,但对每株克隆的分别检测显示 :治疗前YMDD变异株 (YIDD/YVDD)所占比率分别为 0 %、9.5 %、0 %、4.5 %、5 .6%;治疗 48周时所占比率分别为 10 0 %、10 0 %、65 %、10 0 %、0 %。其中 1例患者治疗前检出YIDD变异株 ,而治疗 48周时YVDD变异株则变成优势株。治疗 5 2周时 ,4例YMDD变异患者中 2例HBVDNA和血清丙氨酸转氨酶 (ALT)突破 ,1例患者ALT突破 ,但HBVDNA为阴性。结论 YMDD变异株在拉米夫定治疗前的血清中已存在 ,在服用拉米夫定后 ,由于选择性抑制了野毒株 ,使YMDD变异株由弱势株变成优势株 ,部分患者可导致拉米夫定临床耐药。

乙型肝炎病毒基因型、YMDD变异与拉米夫定治疗后HBV DNA反弹关系的研究

目的探讨HBV基因型、YMDD变异与拉米夫定抗病毒治疗后HBV DNA反弹的关系。方法应用多引物对巢式PCR法、PCR-序列分析法检测拉米夫定治疗的27例乙型肝炎患者和19例从未用过抗病毒治疗的患者HBV基因型和P区(YMDD)的突变位点。结果在27例HBV DNA反弹的患者中,13例(48.15%)检出YMDD变异,而对照人群无YMDD变异(P<0.05)。YMDD变异的位点为rtM204V/(IC区)±rtL180M(B区);在治疗组YMDD变异的患者中,B、C基因型构成比(46.15%和59.26%)与对照组(53.85%和68.42%)比较无显著性差异(P>0.05)。结论YMDD变异是拉米夫定治疗后出现耐药导致HBV DNA反弹的主要原因;YMDD变异的常见位点依然为rtM204V/I(C区)±rtL180M(B区);YMDD变异在B、C基因型病人中无差别。

HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达

通过定点突变技术将HBV质粒p3.8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V6 0和L97。经序列测定和生物学活性检测后 ,亚克隆入EB病毒稳定表达载体。重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实 ,用脂质体介导转染HepG2 细胞稳定传代 ,定量测定各株培养上清HBV抗原表达。结果发现 ,3株HBsAg含量S/N值接近 ,变异株HBeAg含量S/CO值低于野生株。上述

HBVP基因YMDD变异的检测及临床应用的研究

目的 采用错配PCR扩增方法进行HBVP基因YMDD变异的检测 ,对其临床意义进行初步的研究。方法 应用分子克隆方法 ,构建YMDD、YVDD、YIDD变异的阳性质粒 ,并进行敏感性及特异性试验。对 44例经拉米夫定治疗 1年HBVDNA持续阳性的乙型肝炎患者检测YMDD变异情况。结果 经PCR方法、酶切鉴定及直接测序鉴定出YMDD、YVDD、YIDD质粒构建成功 ,且该方法具有较好的敏感性和特异性。 44例拉米夫定治疗 1年HBVDNA持续阳性的乙型肝炎患者存在YMDD变异 ,半年出现变异 5例 ,变异率为 11 . 3 6%:1年出现变异 7例 ,变异率为 15 . 91%。结论 本检测方法简便、实用 ,抗病毒药物压力是导致HBVYMDD变异的重要因素。

乙型肝炎患者血清HBV前C区A83变异株的检测

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C区A83点突变与临床关系。方法:采用聚合酶链反应(PCR)对64例乙型肝炎(乙肝)患者HBV前C区基因进行扩增,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),鉴定前C区第83位核苷酸点突变。结果:34例(53.13%)有A83点突变,其中12例(18.75%)为单独变异株感染,22例(34.38%)为变异株与野毒株混合感染。慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)组高于无症状HBV携带者(ASC)(P<0.05)。抗-HBe(+)组的检出率为70.0%,高于HBeAg(+)组的25.0%(P<0.01),并且随着HBVDNA含量的增高,其发生变异的可能性越大(P<0.05)。结论:前C区A83点突变的发生可能与机体长期的炎症活动、免疫压力的选择有关。

慢性HBV携带者YMDD自然变异的追踪研究

目的探讨慢性HBV携带者YMDD自然变异随时间的推移发生变化的情况。方法随机选择未经抗病毒治疗的慢性HBV携带者103例,分别在开始、1年、2年时观察血清HBV DNA、HBV血清学标志物、肝功能、YMDD变异的变化情况。结果在开始检测的103例慢性HBV携带者中,YMDD阳性27例,观察2年后4例转为非活动性HBsAg携带者且YMDD转为阴性;76例YVDD变异阴性的患者中,观察2年后1例病毒水平增高并出现YMDD变异。结论 YMDD自然变异株在慢性HBV携带者中相对较稳定,YMDD自然变异株可随野生株的消失而消失。

慢性乙型肝炎患者应用拉米夫定治疗发生HBV YMDD变异的研究

目的 探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者应用拉米夫定治疗发生HBV YMDD变异后与患者血清HBVDNA载量关系的临床意义.方法 选择46例应用拉米夫定治疗并发生HBV YMDD变异的CHB患者,另选择未发生HBV YMDD变异的CHB患者作对照组.探讨血清HBVDNA载量与HBV YMDD变异类型、变异发生时间的关系.结果 CHB患者接受拉米夫定治疗前,HBV YMDD变异组HBVDNA载量明显高于HBV YMDD未变异组（P〈0.01）.HBV YMDD变异类型（YVDD、YIDD、YVDD/YIDD）的分布与血清HBVDNA载量无相关性.HBVDNA载量与发生HBV YMDD变异的时间有相关性.随着HBVDNA载量的升高,发生HBV YMDD变异的时间越来越早.结论 应用荧光定量PCR方法检测血清HBVDNA载量和HBV YMDD变异,可动态观察CHB患者拉米夫定治疗后发生HBV YMDD变异的情况,对临床治疗和观察预后具有重要的临床意义.

父儿传播的HBV初步基因分型及变异株检出

为了研究父儿传播的HBV基因型别与变异株 ,以选择 6对配偶无任何HBV标志的男性HBV携带者及其HBVDNA阳性胎儿为对象 ,用双脱氧链末端终止法检测父儿HBVS基因 45 1～ 6 6 0段核苷酸序列。结果 4对父儿无论在核苷酸水平还是在氨基酸水平均一致 ,其中 1对在 12 6位父儿均有氨基酸替代 ,另外 2对父亲无变异 ,1例胎儿在 113、114、131、143位 ,另 1例仅在 143位有氨基酸替代。根据当前的基因分型方法 ,5对父儿均为B型。 1对父儿父亲为B型 ,胎儿在此段序列有A型特点 ,还待进一步研究。表明父儿传播的HBV存在S基因变异株 ,父儿间基因型别基本一致。