毕赤酵母表达的HBV全长Pres蛋白的分离纯化

巴斯德毕赤酵母工程菌株GS115PreS经发酵在甲醇诱导下可高效表达分泌型全长PreS蛋白。Westernblot证明发酵液中存在着可溶性的分子量为48kD的PreS蛋白和蛋白质颗粒,蛋白质颗粒主要成分为48kD的全长Pres蛋白和28kD的S蛋白,电镜观察发现蛋白质颗粒直径为30nm。发酵液经过脱盐、浓缩处理后,上清液经DEAESFF阴离子交换柱得到纯化的PreS蛋白;超速离心和蔗糖密度梯度离心得到蛋白颗粒。该颗粒的主要组分为全长PreS蛋白(PreS1+PreS2+S),还有少量的主蛋白(S)。ELISA检测证明全长PreS蛋白和蛋白颗粒有着良好的抗原性,PN显示蛋白颗粒的抗原性比PreS蛋白的抗原性高。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化

目的优化HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达条件。方法通过改变重组质粒的宿主菌、培养基、诱导温度、诱导剂、诱导剂浓度、诱导时间等条件,利用SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件,分析以上条件改变对表达产物表达量的影响。将重组质粒连续传100代,检测融合蛋白的表达稳定性。结果重组质粒在大肠杆菌BL21菌株、GS培养基、28℃、0.5mmol/L IPTG或1.5mmol/L乳糖诱导4h时,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的43.5%。重组质粒传代100代,融合蛋白的表达稳定。结论已确定出了融合蛋白在大肠杆菌中表达的最佳条件。

HBV PreS2-MBP融合蛋白质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌pMALP2x系统中表达HBVPreS2MBP融合蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2蛋白基因克隆至原核表达载体pMALP2x中,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。表达产物经SDSPAGE和Westernblot检测,并经阴离子交换层析、AmyloseResin亲和层析纯化。结果成功构建了重组载体pMALP2x/S2,诱导蛋白为MBP标记的可溶性的PreS2MBP融合蛋白,具有良好的抗原性,可经AmyloseResin亲和层析纯化。结论pMALP2x系统可成功表达PreS2MBP融合蛋白。

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型。有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点。然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德—毕赤酵母GS115His-中。通过MD-G418平板筛选和5AOX1和3AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株。此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应。

Pres蛋白与HBV的活动性复制及感染关系的研究进展

Ｐｒｅｓ蛋白与ＨＢＶ的活动性复制及感染关系的研究进展姚瑞平，叶春萍综述冯福民周煜清审校乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（ＨＢＶ）感染引起的一种世界性疾病，乙肝对人类的危害极大，近几年来乙肝发病呈回升的趋势，目前医学界在乙肝的防治工作中已开展了诸多的研究，但...

HBV Pre-S1蛋白及HBV-DNA含量检测在诊断乙肝病毒复制中的临床意义

目的:探讨乙肝患者不同血清学标志物模式(HBV-M)与乙肝病毒DNA含量及乙肝病毒前S1蛋白的关系,为预测乙型肝炎病毒的传染程度、预防、诊断及治疗提供实验室依据。方法:采用ELISA法对1385例携带不同血清学标志物的乙肝患者进行HBVPre-S1和乙肝5项指标检测,并用聚合酶链反应定量检测血清HBV-DNA含量。结果:不同HBV免疫模式中HBsAg、HBeAg和HBcAb同时阳性,其HBV-DNA和HBVPre-S1的检出率分别为90.7%和71.1%;HBsAg、HBeAb和HBcAb阳性组的检出率分别为35.8%和27.3%;其他不同血清学模式组也有不同的阳性率。结论:HBV-DNA、乙肝病毒5项标志和HBVPre-S1联合检测,对HBV感染早期诊断,了解病毒的复制情况,疗效观察和预后判断均具有重要意义。

前S_1蛋白抗原(Pre S_1)阳性与乙肝病毒(HBV)血清标志物关联性的分析

为了解天津海港口岸地区前S_1蛋白抗原(Pre S_2)与乙肝病毒血清标志物的相互关系,特对塘沽医院门诊及住院患者7186例血清Pre S_1及HBV血清五项标志物用EIA法及ELISA法进行分析。检测结果发现7186例血清标本中有926例Pre S_1呈现阳性,占总检人数的12.89％(926/7186)。Pre S_1与HBsAg同时存在阳性者922例占Pre S_1阳性的99.57％(922/926)。Pre S_1与HBe系统时存在阳性者851例占Pre S_1阳性的91.9%(851/926)。经分析PreS_1区段的21-47肽段是HBV与肝细胞结合的位点,可参与HBV附着并侵入肝细胞的过程,它可以反映HBV在体内复制和感染的状况,也可作为新的血清学指标替代或补充HBe系统及HBV-DNA,对HBV的监测起着重要的作用,有较高的临床诊断价值。

乙型肝炎病毒PreS1蛋白研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科,是多数肝脏疾病和肝癌的主要发病原因之一。慢性HBV感染是全球化的健康问题,肝癌是世界上最严重的恶性肿瘤之一,死亡率排在第三位,严重威胁人类健康。虽然我们对于这个具有高度肝脏特异性病毒的分子生物学研究的知识有所增加,但是病毒黏附和进入宿主细胞的机制仍是未知数。乙肝病毒PreS1蛋白位于HBV病毒颗粒表面,并在病毒的组装和感染中发挥重要的作用。为了阻止HBV入侵及抗病毒感染,目前一系列基于PreS1抗原肽的方法正在研究中,而这些有可能成为新的抗病毒治疗方法。

HBV转录后调节序列抑制性结合蛋白的研究进展

HBV转录后调节涉及多个环节 ,其中 HBV转录后调节序列 ( posttranscriptional regulatoryelement,PRE)与宿主肝细胞核相应结合蛋白的结合是其中重要一环 ,二者的结合可促进转录体从细胞核向细胞浆的转运。PRE抑制性结合蛋白与 PRE结合能特异性抑制该环节。故 PRE结合蛋白特别是 PRE抑制性结合蛋白的研究 ,为抗 HBV感染提供了一个新的途径。

乙型肝炎病毒PreS1抗原检测的临床应用

PreS1抗原位于乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）组成成分之一大分子蛋白的N末端，只存在于具有传染性的完整的HBV颗粒上，它与乙型肝炎病毒S抗原、前S2共同构成HBV的衣壳蛋白。PreS1含有肝细胞膜受体，可直接与肝细胞膜结合，在HBV感染肝细胞和机体免疫应答中起重要作用。近年来，PreS1作为一种新的HBV标志物已广泛应用于临床。

乙型肝炎病毒表面大蛋白检测的临床应用研究

目的探讨乙型肝炎病毒表面大蛋白(LHBs)用于临床乙型肝炎诊断的实验价值及与乙型肝炎病毒DNA定量的相关性。方法应用基因工程表达的乙型肝炎病毒表面大蛋白,采用ELISA技术共检测了510份HBsAg阳性血清标本中的LHBs,同时检测前S1抗原(PreS1Ag)及HBeAg,并应用荧光定量PCR技术平行检测HBVDNA。结果380份HBV DNA阳性血清标本中,361份(95.00%)LHBs检测阳性,PreS1Ag192份(50.50%)检测阳性;LHBs阳性率明显高于乙型肝炎前S1阳性率,两者差异有统计学意义(P<0.01);239份HBeAg阴性血清标本中,HBV DNA129份(53.93%)阳性,LHBs132份(55.23%)阳性,PreS1Ag77份(32.22%)阳性,LHBs阳性率与HBV DNA阳性率差异无统计学意义(P>0.05),均显著高于PreS1Ag;LHBs含量与HBV DNA拷贝数呈正相关性,相关系数r=0.946。结论LHBs是一个操作简便的可用于反映乙型肝炎病毒复制水平的敏感指标。

基因免疫中HBV preS对HCV E2蛋白免疫原性的调控

在丙型肝炎病毒的自然感染过程中，机体无足够的中和抗体来清除循环中的ＨＣＶ，但只有高滴度的抗包膜蛋白抗体才能完全保护猩猩免受ＨＣＶ的感染〔１〕。在ｐｒｅＳ－Ｓ疫苗中，ｐｒｅＳ能显著增加Ｓ抗体的产生，使单独接种Ｓ抗原无反应的小鼠产生显著的抗ＨＢｓ反应〔２...

乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶反式调节蛋白1基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 以HBVDNA聚合酶逆转录酶表达质粒pcDNA3 .1( ) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶反式调节 ,故命名为DNA多聚酶反式调节蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 逆转录酶反式调节新靶基因DNAPTPl的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

ELISA法检测乙肝患者血清乙肝病毒前S1蛋白

目的:探讨检测乙型肝炎病毒前S1蛋白(Pre-S1)的临床意义。方法:本文用酶联免疫分析(enzymelinkedimmuno-adsorbedassay,ELISA)法对22例急性乙型肝炎患者及160例慢性乙型肝炎患者进行Pre-S1蛋白及HBV标志物检测,同时用荧光定量PCR法(fluorescencequantitativepolymemsechainreaction,FQ-PCR)检测HBV-DNA。结论:在急性乙型肝炎中,Pre-S1转阴,提示疾病的预后良好;Pre-S1蛋白和HBV-DNA相关较大,能反映HBV复制,有可能作为体内HBV复制的实验室指标。