受体相互作用蛋白激酶-3参与甲型流感病毒H1N1感染C57BL/6小鼠诱导特异性CD8^+T细胞应答

目的研究受体相互作用蛋白激酶-3(receptor-interacting protein 3, RIP3)在C57BL/6小鼠感染甲型流感病毒H1N1 PR8后,在特异性CD8+T细胞免疫应答中的作用。方法用剂量为0.7×10^3半数组织细胞感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID 50 )的甲型流感H1N1 PR8病毒株,通过滴鼻方式分别感染RIP3敲除(RIP3 -/-)和野生型(WT)的C57BL/6小鼠。在感染后第8天(day post infection, d.p.i)分离小鼠脾细胞,使用流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测流感抗原特异性CD8+T细胞数量及功能:MHC I表位肽四聚体法(tetramer staining)染色流感特异性CD8+T细胞,细胞内细胞因子染色法(intracellular cytokine staining, ICS)检测CD8 +T细胞产生IFN-γ、TNF-α、IL-2等效应性细胞因子水平和与CD8+T细胞杀伤功能有关的颗粒酶(granzyme B)的表达情况。结果 0.7×10^3 TCID 50 流感病毒感染后,WT小鼠中流感抗原特异性CD8 +T细胞比例为RIP3 -/-小鼠的2.71倍;WT小鼠中CD8+T细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2的能力均显著高于RIP3 -/-小鼠( P<0.01);且WT小鼠CD8+T表达granzyme B水平显著高于RIP3 -/-小鼠( P<0.01)。结论本研究在甲型流感病毒感染的小鼠体内发现敲除RIP3分子可导致流感感染诱导的特异性CD8+T细胞数量减少、功能降低,表明RIP3是参与流感抗原特异性CD8 +T细胞的诱生及功能发挥的关键分子之一。

活动性慢性乙型肝炎患者特异性CD8^+T细胞转录因子T-bet表达及临床意义

目的分析转录因子T-bet在活动性慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8+T细胞中的表达及其临床意义。方法用HBV肽五聚体结合流式细胞仪检测HLA-A2阳性的活动性慢性乙型肝炎患者和急性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8+T细胞中T-bet的表达。比较分析HBV特异性CD8+T细胞中T-bet表达在急性、慢性乙型肝炎之间的差异,并进一步分析慢性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+T细胞中T-bet表达与HBV DNA水平、ALT水平以及临床预后之间的相关性。结果急性乙型肝炎患者外周血HBV特异性CD8+T细胞中T-bet表达水平显著高于活动性慢性乙型肝炎患者。活动性慢性乙型肝炎患者及CHB患者外周血HBV特异性CD8+T细胞中T-bet表达水平与HBV DNA水平及ALT水平无明显相关性,HBV特异性CD8+T细胞中T-bet表达水平高的活动性慢性乙型肝炎患者发生HBeAg血清转换率显著升高。结论活动性慢性乙型肝炎患者特异性CD8+T细胞转录因子T-bet表达与HBV感染的免疫控制密切相关。

乙肝病毒核心抗原特异性CD8^+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与HBV-DNA、ALT的相关性研究

目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒核心抗原特异性CD8^+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)、谷丙转氨酶(ALT)的相关性。方法选择47例急性乙肝患者作为急性乙肝组,同期39例慢性乙肝活动期患者作为慢性乙肝组,同期28例健康体检者作为对照组,比较三组核心抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞及相关因子(Core18-27、Env335-343、Pol575-583)、HBV-DNA、ALT、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆红素(TBIL)水平,分析乙肝病毒核心抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞及相关因子与HBV-DNA、ALT的相关性。结果急性乙肝组Core18-27、Env335-343、Pol 575-583水平分别为(1.24±0.51)%、(0.09±0.01)%、(0.09±0.02)%,高于对照组的(0.09±0.02)%、(0.06±0.02)%、(0.07±0.02)%和慢性乙肝组的(0.05±0.01)%、(0.04±0.01)%、(0.03±0.01)%,且对照组均高于慢性乙肝组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。急性乙肝组HBVDNA、ALT、AST、GGT及TBIL水平分别为(21.59±4.32)×10^3 copies/ml、(85.35±5.49)U/L、(120.59±12.19)U/L、(125.98±13.42)U/L、(40.39±1.32)μmol/L,均高于慢性乙肝组的(13.21±3.29)×10^3 copies/ml、(62.14±5.05)U/L、(87.56±6.87)U/L、(102.12±10.06)U/L、(25.49±1.21)μmol/L和对照组的0、(32.21±3.25)U/L、(30.29±3.41)U/L、(33.49±3.09)U/L、(12.59±0.14)μmol/L,且慢性乙肝组高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Core18-27、Env335-343和Pol 575-583与HBV-DNA、AST、ALT、GGT及TBIL水平均呈正相关(P<0.05)。结论乙肝病毒核心抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞及相关细胞因子与HBV-DNA、ALT存在相关性,加强其表达水平测定反映疾病严重程度,有助于指导临床治疗。

α-CD3单抗对肿瘤特异性T细胞的扩增及其杀瘤活性的影响

用α-CD3单抗激活FBL-3红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞获取肿瘤特异性T细胞，并观察α-CD3单抗对肿瘤特异性T细胞的增殖、杀瘤话性及表型变化的影响。研究采用四种不同的培养方案。(1)单独使用α-CD3单抗(CD3组)；(2)单独使用20U／ml rIL-2(IL-2组)；(3)使用α-CD3单抗48小时后仅加入20U/ml rIL-2(CD3^-IL-2组)

甲型H1N1流感病毒感染年轻和老年C57BL/6小鼠 诱导肺组织CD8^(+)T细胞特异性免疫应答的比较研究

目的比较甲型H1N1流感病毒PR8毒株感染老年和年轻C57BL/6小鼠诱导肺组织CD8^(+)T细胞特异性免疫应答的能力。方法使用490 PFU的PR8病毒分别滴鼻感染年轻(3月龄)和老年(24月龄)C57BL/6小鼠,连续14 d每日记录其体重变化及死亡情况。在感染后第8天分离小鼠肺组织细胞,使用流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)技术检测病毒抗原特异性CD8^(+)T细胞数量及功能:MHC-I表位肽四聚体法(tetramer staining)染色流感特异性CD8^(+)T细胞,细胞内细胞因子染色法(intracellular cytokine staining,ICS)检测CD8^(+)T细胞经流感病毒特异性肽刺激后分泌细胞因子水平包括TNF-α、IFN-γ、IL-2以及与CD8^(+)T细胞杀伤功能有关的颗粒酶B(Granzyme B)的水平。结果相同量的PR8流感病毒感染小鼠后,老年小鼠体重下降更多,死亡率显著高于年轻小鼠(P<0.01)。另一方面,老年组小鼠诱生的病毒特异性CD8^(+)T细胞比例显著低于年轻组;同时,老年组CD8^(+)T细胞活化后分泌细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2的水平显著低于年轻组;此外,老年组CD8^(+)T细胞表达granzyme B的水平同样显著低于年轻组。结论PR8流感病毒感染老年和年轻C57BL/6小鼠后,老年小鼠肺组织诱导产生的特异性CD8^(+)T细胞的数量减少且功能降低。结果表明:与年轻小鼠相比,老年小鼠肺组织CD8^(+)T细胞特异性免疫应答功能受损。

抗CD4单抗增强抗CD3单抗/IL-2活化的肿瘤特异性T细胞的抗瘤活性

目的探讨抗CD4mAb增强抗CD3mAb刺激的肿瘤特异性T细胞增殖和杀瘤活性的作用。方法将肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞,采用4种不同的方案培养1单独加2×104U/LrIL2IL2组2单独加抗CD3mAb抗CD3组3加抗CD3mAb48h后,再加入抗CD3mAb和2×104U/LrIL2抗CD3+IL2组4同时加抗CD3mAb和抗CD4mAb48h后,再加入抗CD3mAb、抗CD4mAb和2×104U/LrIL2抗CD3+IL2+抗CD4组。然后分别检测4组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型。结果抗CD3+IL2组细胞的3HTdR掺入量在第6,12和20d分别为:22045、13986和1931;抗CD3+IL2+抗CD4组细胞的3HTdR掺入量在第6、12和20d,分别为46193、31047和7443,后者明显高于前者P0.05。在培养12d时,抗CD3+IL2组的细胞对FBL3细胞株的最大杀伤率为83.6%;抗CD3+IL2+抗CD4组细胞的最大杀伤率为91.7%。细胞表型:FACS分析表明,抗CD3+IL2+抗CD4组培养12d的细胞,99%以上为Thy1.2+细胞,且CD4+、CD25+细胞的百分率均高于抗CD3+IL2组。结论抗CD4mAb对抗CD3mAb刺激、IL2诱导的肿瘤特异性T细胞的增殖和杀瘤活性具有增强作用。

病毒特异性CD8^＋T细胞抗病毒免疫的研究进展

病毒利用宿主细胞核酸和蛋白质装置进行增殖,并与宿主细胞表面的受体结合,感染众多靶细胞.一旦建立感染,抗原呈递细胞通过内源性抗原呈递途径加工、呈递病毒抗原,激活机体免疫应答.病毒特异性免疫主要机制是细胞毒性T淋巴细胞作用,清除病原体和感染的靶细胞,同时CD8+T细胞分化为记忆T细胞,介导再次免疫应答.

艾滋病患者HIV-1抗原特异性CD8^+记忆性母细胞样T细胞的扩增

目的对艾滋病患者人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)抗原特异性CD8^+记忆性母细胞样T细胞(TSCM)的扩增进行分析。方法纳入10例HIV-1感染者作为研究对象,磁珠法分离艾滋病患者CD8^+T淋巴细胞,并利用Tetramer-SL9标记T细胞表面抗原受体。利用流式细胞术检测标记有流式抗体的HIV-1抗原特异性CD8^+TSCM的分布情况,利用细胞因子探索其扩增。结果 HIV-1抗原特异性CD8^+TSCM在CD8^+T淋巴细胞中的比例,随着时间延长,可诱导出更多的TSCM细胞,但是峰值在10 d左右。结论艾滋病患者CD8^+T细胞中TSCM细胞的存在,用HIV-1抗原表位(SL9)来标记安全性高,扩增效果好,可为艾滋病的过继免疫治疗提供技术参考。

乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗前后抗原特异性CD8^(+)T细胞功能分析

目的观察乙型肝炎肝硬化抗病毒治疗前后外周血HBV抗原特异性T细胞的数量功能与临床预后的相关性。方法经HLA-A2分型检测选取46例患者,采用主要组织相容性复合物(MHC)-抗原肽四聚体标记技术,经流式细胞仪检测乙型肝炎肝硬化患者抗病毒治疗前后外周血HBV抗原特异性CD8^(+)T细胞百分比,并对其细胞因子分泌能力及表型进行检测分析。结果46例人类白细胞相关抗原HLA-A2阳性者中,检出抗原特异性CD8^(+)T细胞表达的为22例。TDF治疗后患者ALT为(31.29±18.42)U/L,较治疗前(124.05±29.18)U/L明显下降(t=72,P=0.015),HBV DNA全部转阴,转阴率为100%。治疗后抗原特异性的CD8^(+)T细胞数量为(1.15±0.37)%,明显高于治疗前的(0.65±0.25)%(t=59,P<0.01);治疗后γ干扰素为(6.86±2.08)%,明显高于治疗前(3.58±1.26)%(t=46,P<0.01);抗病毒治疗后HBV表位特异性的CD8^(+)T细胞表达抑制性因子PD-1的细胞百分比为(0.43±0.19)%,低于治疗前的(0.76±0.43)%(t=131,P=0.0084);HBV表位特异性的CD8^(+)T细胞表达活性因子CD28的细胞百分比为(1.03±0.45)%,高于治疗前的(0.56±0.26)%(t=100,P=0.0006)。结论乙型肝炎肝硬化患者外周血中抗原特异性CD8^(+)T细胞存在功能缺陷,经抗病毒治疗后抗原特异性CD8^(+)T细胞数量和功能有一定程度的增强。

CD8^+CD28^-调节性T细胞及血小板特异性自身抗体在免疫性血小板减少症中的表达

目的检测免疫性血小板减少症(ITP)患者外周血中CD8^+CD28^-调节性T细胞(Treg)、血小板特异性自身抗体、细胞因子的表达水平,分析其在ITP发病机制以及临床治疗中的意义。方法 73例ITP患者分为激素治疗组( n =42)、重组人粒血小板生成素(rhTPO)治疗组( n =31),并根据治疗效果分为有效组和无效组。流式细胞术检测患者治疗前后外周血CD8^+CD28^- Treg的表达,流式微球技术检测患者外周血血小板特异性自身抗体的表达。ELISA法检测患者治疗前后转化生长因子(TGF)-β1、白介素(IL)-10和干扰素(IFN)-γ表达水平。以30例健康体检者作为正常对照组。结果① 73例ITP患者治疗前CD8^+CD28^-Treg及细胞因子IL-10、TGF-β1的表达低于正常对照组,IFN-γ表达高于正常对照组( P <0.05),激素及rhTPO治疗后有效组CD8^+CD28^- Treg、IL-10、TGF-β1的表达均比治疗前显著上升,IFN-γ的表达较治疗前显著降低( P <0.05)。无效组CD8^+CD28^- Treg、IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表达和治疗前相比均未有明显变化。②根据受试者工作特征曲线(ROC),激素组治疗前CD8^+CD28^-Treg的临界值为14.35,此时预测激素疗效的敏感性和特异性分别为66.7%和73.3%。27例有效者中小于14.35的有18例(66.7%),15例无效者中大于14.35的有11例(73.3%)。rhTPO组治疗前CD8^+CD28^-Treg的临界值为15.45,此时预测rhTPO疗效的敏感性和特异性分别为63.6%和88.9%。22例有效者中大于15.45的有14例(63.6%),9例无效者中小于15.45的有8例(88.9%)。③激素组抗血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)抗体阳性患者18例,治疗后有效率44.4%,抗GPIb抗体阴性24例,有效率79.1%,两者比较差异有统计学意义( P <0.05)。结论 CD8^+CD28^- Treg及相关细胞因子的表达异常参与了ITP的发病,激素和rhTPO可能通过改变这种异常发挥作用。治疗前检测CD8^+CD28^-Treg有助于预测激素及rhTPO的疗效。抗GPIb抗体阳性可能是激素治疗不敏感的影响因素之一。

Renca细胞exosomes所诱导的CD8^+T细胞的特异性杀伤作用

目的检测Renca细胞exosomes对CD8^+T细胞的激活效应以及exosomes负载的树突状细胞(DCs)所诱导的CD8^+T细胞对Renca细胞特异性杀伤作用。方法采用超速离心法从Renca细胞无血清上清液中提取出exosomes并鉴定,体内通过流式和ELISA;体外通过CFSE荧光染色和ELISA检测exosomes对CD8^+T细胞的激活效应。小鼠骨髓分离出DCs并进行体外培养,用exosomes冲击成熟的DCs然后活化CD8^+T细胞,测定其对Renca、4T1、CT26细胞的杀伤率。结果透射电镜下观察exosomes是直径在30~100 nm的盘状囊泡,Western blot检测exosomes高表达MHC-1和HSP70。Exosomes能在体内和体外促进CD8^+T细胞的增殖和激活效应。在体外杀伤实验中,exosomes冲击的DCs所诱导的CD8^+T细胞相对于4T1和CT26细胞,其对Renca细胞具有明显更强的杀伤作用。结论 Renca细胞exosomes对CD8^+T细胞具有明显的激活作用且exosomes负载的DCs所诱导的CD8^+T细胞对自体肿瘤细胞具有强烈的特异性杀伤能力。

乳腺癌CD4^+ CD25^(high) Foxp^(3+)调节性T细胞数量和分布及Foxp3mRNA表达与肿瘤分期的相关性研究

目的研究乳腺癌患者CD4+CD25high Foxp3+调节性T细胞(T regulatory cell,Treg)的存在数量、分布情况,及其功能基因Foxp3mRNA的表达变化与国际抗癌联盟(UICC)乳腺癌的TNM分期的关系。方法用四色流式细胞术以Foxp3-FITC/CD25-PE/CD4-PerCP/CD3-PC7抗体组合分析40名健康对照者及40例乳腺癌患者(临床TNM分期T1期9例、T2期10例、T3期12例、T4期9例)外周血、肿瘤组织浸润淋巴细胞(TIL)及癌旁淋巴结中CD4+CD25high Foxp3+Treg的数量及分布情况。实时荧光定量PCR技术检测TregFoxp3mRNA表达水平。结果乳腺癌患者外周血CD4+CD25high Foxp3+Treg占CD4T细胞的百分比为(8.91±3.06)%,高于正常健康对照组(5.84±2.63)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。乳腺癌患者TIL、癌旁淋巴结中Treg占CD4+T淋巴细胞比例均高于外周血,差异有统计学意义(P均<0.01)。乳腺癌组织TIL和癌旁淋巴结中Treg的Foxp3平均荧光强度(MFI)显著高于外周血(P<0.05)。T1、T2、T3、T4期乳腺癌患者Treg比例分别为(5.81±1.89)%、(6.52±2.15)%、(9.65±3.14)%、(11.86±2.43)%。乳腺癌患者外周血单个核细胞Foxp3mRNA表达水平明显高于健康对照组(P<0.01)。相关分析显示,Treg数量与肿瘤TNM分期显著相关(r=0.7 576,P<0.01);Foxp3基因mRNA表达水平与乳腺癌TNM各分期呈显著相关性(r=0.6 129,P<0.05)。结论乳腺癌患者CD4+CD25high Foxp3+Treg的数量升高,其增高程度与肿瘤临床分期呈显著正相关。乳腺癌患者外周血和癌组织局部Treg的数量、分布情况及特异性转录因子Foxp3mRNA的表达强度均有所不同,提示这可能是产生肿瘤免疫抑制的重要机制,CD4+CD25high Foxp3+Treg将来可作为乳腺癌患者病情进展的重要判断指标之一。

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

1,25二羟基维生素D_3对大鼠脾调节性T细胞及其特异性转录因子表达的影响

目的:探讨用1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2VitD3]预干预对大鼠辅助性T细胞(Th1)免疫应答中脾CD4+CD25+调节性T细胞及其特异性转录因子Foxp3基因表达的影响。方法:采用近交系大鼠,随机分为对照组、脂多糖(LPS)组和VitD3组。分别给予对照组和LPS组赋形剂,VitD3组用1,25(OH)2VitD3(0.25μg/只.d-1),连续灌胃14 d。第15天LPS组和VitD3组腹腔注射致死剂量LPS(10 mg/kg)。6 h后处死,用流式细胞仪检测脾CD4+CD25+调节性T细胞比例,用Realtime RT-PCR检测脾中Foxp3 mRNA的表达。结果:1,25(OH)2VitD3明显上调大鼠Th1免疫应答中脾CD4+CD25+调节性T细胞的比例及其特异性转录因子Foxp3 mRNA的表达。结论:1,25(OH)2VitD3预干预对大鼠Th1免疫应答中脾CD4+CD25+调节性T细胞及其特异性转录因子Foxp3的基因表达有显著影响。1,25(OH)2VitD3有可能通过促进CD4+CD25+调节性T细胞的发育,发挥其免疫调节作用。

COVID-19患者体内SARS-CoV-2特异性的记忆性CD8^(+)T细胞和抗体水平的变化

目的研究SARS-CoV-2病人恢复期的病毒特异性的记忆性T细胞和抗体水平的变化。方法通过SARS-CoV-2特异性抗原肽刺激COVID-19病人来源PBMC,流式细胞术检测不同疾病严重程度COVID-19患者SARS-CoV-2特异性的记忆性CD8^(+)T细胞的数目以及功能,ELISA检测不同疾病严重程度COVID-19患者血清中S1、S2特异性的IgG水平。结果与中、重症COVID-19患者相比,无症状或轻症的COVID-19患者体内拥有数目更多,质量更好的SARS-CoV-2特异性的记忆性CD8^(+)T细胞;中、重症SARS-CoV-2感染患者血清中病毒特异性IgG水平随着时间延长而降低,维持时间较短。结论无症状和轻症COVID-19患者体内拥有质量更好的病毒特异性的记忆性CD8^(+)T细胞。

采用IL-12刺激慢性HBV携带者的外周血单核细胞可促进HBV-特异性中心记忆型CD8＋T细胞反应

为了治疗HBV感染，了解在HBV感染个体中免疫耐受或低反应性的机制是非常重要的。在本项研究中作者检测了慢性无症状HBV携带者的细胞免疫状态并设法找出促进其特异性细胞免疫反应的对策。HBV非特异抗原性和特异性抗原单独或与IL-12联合用于激活来自HBV携带者和健康对照者外周血单核细胞（PBMCs）以评价其细胞因子反应。

人巨细胞病毒抗原特异性CD4^＋T细胞分泌细胞因子诱导内皮细胞Fractalkine的表达[英]／Bolovan-Fritts CA…／／J Virol.

巨细胞病毒(CMV)为双链DNA病毒，属于β疱疹病毒科。已有证据表明，CMV感染与一些炎症相关疾病，如血管性疾病以及慢性移植物排斥反应等有关。但迄今为止如何影响这些疾病的发生尚不清楚。本文作者用来自CMV血清阳性和阴性供者的外周血单个核细胞(PBMC)分别与人主动脉内皮细胞(AEC)的单层细胞孵育，用特异性抗原(热灭活的人CMV株AD169)刺激3d，

慢性乙型肝炎患者外周血CD4^+CD25^+FOXP3 T淋巴细胞的检测及意义

人体感染HBV后结局取决于宿主免疫反应,T细胞介导细胞免疫在机体清除HBV过程中起着关键性的作用,慢性乙型肝炎患者存在HBV特异性T细胞活化障碍[1]。自Sakaguchi等[2]于1995年在未免疫小鼠外周血循环中发现了CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg）后，