HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白的亚细胞定位研究

目的 运用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究,为进一步研究HBV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供一定的思路和方向。方法应用酵母双杂交系统筛选人胰腺cDNA文库中的LHBs结合蛋白基因,构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,应用激光共聚焦显微技术对CDK5RAP3与LHBs进行亚细胞定位研究。结果成功构建真核表达质粒pDsRed1-N1-CDK5RAP3,转染了pDsRed1-N1-CDK5RAP3质粒的细胞,红色荧光信号较集中分布于细胞浆中,与经DAPI染色的细胞核无重叠。结论证实LHBs基因和CDK5RAP3基因在体内可以表达蛋白,并提示LHBs蛋白和CDK5RAP3蛋白均主要定位在细胞浆内。

哺乳动物双杂交技术验证HBV表面抗原大蛋白与人胰腺CDK5RAP3蛋白间的相互作用

目的验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内是否存在相互作用关系,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础。方法构建真核表达质粒pACT-CDK5RAP3,哺乳动物双杂交技术验证LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白之间的相互作用。结果实验组和各阴性对照组差别均有统计学意义(P<0.05)。结论LHBs与人胰腺CDK5RAP3蛋白在细胞内存在相互作用关系,且单独转染后没有自身激活作用。

乙肝表面抗原大蛋白与HBV DNA的比较及其与ALT的关系

目的:检测不同模式乙肝患者血清中乙肝表面抗原大蛋白(HBV-LP)、乙肝前S1,HBV DNA以及ALT,比较HBV-LP以及乙肝前S1的检出与HBV DNA及ALT之间的关系,探讨HBV-LP用于乙肝患者临床诊断的意义．方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测177例HBV患者血清HBV-LP和乙肝前S1,荧光定量PCR方法检测患者HBV DNA,全自动生化分析仪检测ALT．结果:相同乙肝模式患者血清HBV-LP与HBV DNA检出率无显著差异;HBeAg阳性患者血清中HBV-LP与HBV DNA阳性率均明显高于HBeAg阴性患者(95．45％vs 44．36％,P<0．05; 93．18％vs 41．35％,P<0．05):相同乙肝模式患者血清乙肝前S1的检出低于HBV DNA的检出,两者差异显著(P<0．05);HBV-LP阳性患者的ALT明显高于HBV-LP阴性患者．结论:乙肝表面抗原大蛋白与HBV DNA有较高的符合率,是反映乙肝患者体内病毒复制情况的可靠指标;而且乙肝表面抗原大蛋白阳性患者ALT较阴性患者高,表明HBV-LP同时也反映了乙肝病情的活动情况．

HBV表面抗原大蛋白与人胰腺突触角蛋白6之间的相互作用

目的验证HBV表面抗原大蛋白(LHBs)与人胰腺突触角蛋白6(STX6)在细胞内是否存在相互作用,为进一步研究HBV影响糖、脂代谢机制奠定研究基础。方法构建真核表达质粒pACT-STX6,采用哺乳动物双杂交技术验证LHBs与STX6之间的相互作用。结果实验组和各阴性对照组相对荧光素酶活性值均存在差异,且均具有显著统计学意义(P<0.01)。结论 LHBs与人胰腺STX6在胰腺细胞内存在相互作用。

HBV截短的表面抗原蛋白MHBs^t的反式激活作用

羧基末端截短的 ( truncated)乙型肝炎病毒 ( HBV)表面抗原中蛋白 ( MHBst)能够反式激活多种病毒或细胞基因启动子的转录功能 ,与 HBV相关的肝细胞癌 ( hepatocellular carcinoma,HCC)发生密切相关。MHBst至少完全缺失蛋白 C-末端 S区的疏水区 ,才具有反式激活功能 ;S区的 N-末端疏水区 是反式激活所必须的 ,对应的编码基因 Pre S2 / S有效缺失位点在 2 2 1～ 573位核苷酸之间 ,这段核苷酸序列被称为“反式活性开启区”( trans- activity- on region,TAO)。MHBst的反式激活功能依赖于其 N-末端 Pre S2区的胞浆定位功能 ,激活的机制可能与 PKC依赖的信号转导途径有关。

羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达

目的构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式激活基因的消减文库,并观察其对细胞原癌基因c-myc的反式激活作用。方法以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-MHBst和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,分别标记为实验组与对照组,应用抑制性消减杂交技术,构建MHBst反式激活的cDNA消减文库。针对其中的原癌基因c-myc,进一步克隆其启动子序列并构建报告基因表达载体pCAT3-c-myc,与pcDNA3.1(-)-MHBst共转染HepG2细胞,ELISA法检测报告基因氯霉素乙酰转移酶CAT的表达活性。同时,应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹方法检测表达MHBst的细胞中c-myc基因的mRNA转录和蛋白表达水平。结果随机挑选消减文库中的50个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,显示19种已知功能基因,涉及细胞代谢、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生等生物学过程。细胞内瞬时表达的MHBst蛋白能够反式激活细胞原癌基因c-myc启动子的转录活性,并且RT-PCR和Western blotting结果也证明了表达MHBst蛋白的细胞中原癌基因c-myc的表达水平明显增强。结论成功构建MHBst反式激活基因的消减文库,MHBst可以反式激活细胞原癌基因c-myc的表达,为深入了解乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础。

哺乳动物双杂交技术验证HBV表面抗原大蛋白与胰腺弹性蛋白酶2A的相互作用

目的验证乙型肝炎病毒（hepatitisBvires，HBV）表面抗原大蛋白（hepatitisBvireslargesurfaceprotein，LHBs）与人胰腺弹性蛋白酶2A（elastase2A）蛋白在细胞内是否存在明确的相互作用关系。方法构建真核表达质粒pACT—Elastase2A，设立阳性对照组、实验组、阴性对照组和空细胞组，用哺乳动物双杂交技术验证LHBs与人胰腺Elastase2A蛋白之间的相互作用。结果实验组与3个阴性对照组之间，均数都存在统计学差异（其P值分别为0．031、0．006和0．007）。结论哺乳动物双杂交技术证实了从慨与人胰腺Elastase2A蛋白在Capan2细胞内存在相互作用关系。

一个能分泌出哺乳动物细胞的HBV表面抗原大蛋白

本文用定向突变方法缺失了人乙型肝炎病毒表面抗原氨端位于preS1区的54个碱基对(编码氨基酸2—19).该基因在猴肾细胞株COS-M6中表达的产物(S301蛋白)和野生型表面抗原大蛋白不同.它不但能被分泌出细胞,而且对表面抗原主蛋白分泌的抑制作用大大减弱,提示了缺失区域中含有一个阻止大蛋白分泌的滞留顺序.S301蛋白的分泌依赖于主蛋白的表达,而且它们的分泌有同步性.和野生型表面抗原大蛋白一样,S301蛋白在COS细胞中合成后能转移至内质网膜,并被糖基化.它对热稳定,对蛋白酶不敏感,并保留了大蛋白和主蛋白的抗原性.由于S301蛋白具有易分泌、稳定性好、抗原性和大蛋白相同等特点,它很可能成为新一代的防治肝炎的基因工程疫苗.

HBV表面抗原大蛋白与C53蛋白在肝细胞内的相互作用研究

目的采用酵母双杂交方法筛选出肝细胞内HBV表面抗原大蛋白(LHBs)的结合蛋白,并验证LHBs与C53蛋白在肝细胞内的相互作用。方法构建pGBKT7-LHBs作为诱饵质粒,从人肝脏cDNA文库中筛选与其相互作用蛋白的编码基因,发现其中包括C53基因。分别构建pCMV-5a-C53和pACT-C53质粒,采用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀的实验方法验证肝癌细胞系HepG2内这两种蛋白之间的相互作用。结果成功从肝脏cDNA文库筛选出C53蛋白;成功构建了pCMV-5a-C53和pACT-C53质粒,并通过哺乳动物双杂交及免疫共沉淀方法明确了LHBs及C53在肝细胞内的相互作用。结论肝癌细胞系HepG2中LHBs及C53存在明确的相互作用,为进一步研究二者的相互作用及对相关生物学功能的影响奠定了前期基础。

乙肝病毒表面抗原大蛋白与HBV复制状况的相关分析

目的:通过检测慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者血清中乙肝病毒表面抗原大蛋白(large surface protein,LHBs)、HBV DNA以及乙肝病毒标志物(HBsAg/HBsAb、HBeAg/HBeAb、HBcAb,简称HBV-M)模式测定,探讨LHBs与HBV DNA及HBV-M模式间的关系,研究LHBs反应HBV复制情况的可靠性,揭示HBeAg阴性乙肝患者检测LHBs的临床意义。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对LHBs和乙型肝炎抗原抗体五项进行检测;采用荧光定量PCR方法对HBV DNA进行检测。结果:534份乙肝患者HBV DNA、LHBs、乙型肝炎抗原抗体五项的检测结果显示:LHBs阳性与HBeAg阴性间测定结果差异有统计学意义(P=0.001,χ2=10.847),不同HBV-M模式的HBV DNA与LHBs检出结果差异有统计学意义(P<0.001,χ2=37.8761)。结论:LHBs是从蛋白水平反应HBV感染者体内病毒复制程度的可靠指标,血清中的LHBs与HBVDNA具有较好的相关性,尤其是HBeAg阴性患者LHBs检测可作为体内病毒复制及预后判断的良好血清学指标。

乙肝表面抗原大蛋白与HBV DNA相关性分析

目的:探讨血清乙肝表面抗原大蛋白(LHBs)与HBV复制的关系。方法:用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测385份HBV患者血清标本LHBs和HBV免疫标志物,同时用荧光定量聚合链反应(FQ-PCR)法检测HBV-DNA含量。结果:132份e抗原阳性患者血清标本LHBs的阳性率93.1%;HBV-DNA的阳性率97.7%;202份e抗原阴性患者血清标本LHBs的阳性率高达42.1%,HBV-DNA的阳性率47.0%,两组阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。100例健康对照血清标本LHBs全部为阴性。结论:LHBs与HBV-DNA有良好的相关性,是HBV复制的重要指标,检测LHBs对判断HBV复制、特别是对基层单位指导e抗原阴性患者的治疗有重要临床意义。

慢性HBV患者血清乙肝病毒表面大蛋白检测与临床意义

目的探讨HBV感染者血清中乙肝表面抗原大蛋白(HBV-LP)水平对HBV复制状态的判定和对临床抗病毒治疗的指导意义。方法对90例接受抗病毒治疗的慢性HBV患者,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR法定期进行血清HBV-LP和HBV DNA定量检测,对检测数据进行相关性分析。结果抗病毒治疗前90例次感染血清中HBV-LP与HBV DNA检出阳性率差异无显著性(P>0.05)。检测210例次感染血清中,HBV-LP含量与HBV DNA具有良好的相关关系(r=0.857,P=0.000),HBV-LPOD值和HBV DNA拷贝数随抗病毒治疗时间的延长同步下降。结论血清中HBV-LP能反映体内HBV复制水平,抗病毒治疗过程中HBV-LP和HBV DNA同步下降,可用于判断HBV复制程度和用于指导抗病毒治疗。

牛α-S1-酪蛋白-乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达

利用ＤＮＡ重组技术，将牛αＳ１酪蛋白调控区基因（１６ｋｂ的片段）与乙肝表面抗原基因拼接，构建了融合基因表达构件：λ１０６。构件经转基因技术转入山羊受精卵。待受精卵发育至成熟个体并分娩、泌乳，ＥＬＩＳＡ检测其乳汁中的ＨＢｓＡｇ，证明所构建的牛αＳ１酪蛋白基因表达构件是可以在羊乳腺中表达乙肝表面抗原基因。

HBV基因疫苗联合抗原蛋白免疫小鼠的研究

目的构建乙肝病毒（ＨＢＶ）基因疫苗，观察其与ＨＢＶ表面抗原蛋白（ＨＢｓＡｇ）联合免疫小鼠诱导的免疫应答．方法构建重组真核表达质粒ｐＣＲ３１Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗，联合应用纯ＨＢｓＡｇ蛋白免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，以单用基因疫苗ｐＣＲ３１Ｓ或纯蛋白ＨＢｓＡｇ免疫小鼠作为对照组．采用ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗ＨＢｓ，另取免疫小鼠脾细胞，用３ＨＴｄＲ掺入法测定各组免疫小鼠的淋巴细胞增殖活性．结果２，４ｗｋ时联合免疫组抗ＨＢｓ效价低于纯蛋白免疫组，高于基因疫苗免疫组；６ｗｋ后基因疫苗免疫组抗ＨＢｓ效价升至最高，联合免疫组次之．３ＨＴｄＲ掺入法测定显示，各组免疫小鼠的淋巴细胞增殖反应差异不显著．结论乙肝病毒基因疫苗与表面抗原蛋白联合免疫无优势．

血清类粘蛋白2下调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ转录活性的研究

目的:探讨血清类粘蛋白2(ORM2)对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV-SP Ⅰ)转录的激活作用. 方法:以我实验室前期得到的HBV-SP Ⅰ的酵母单杂交系统筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定ORM2的基因编码区域,聚合酶链反应(PCR)扩增ORM2编码基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)- ORM2载体;将该质粒与SP Ⅰ的氯霉素乙酰转移酶(CAT) 报告载体pCAT3-SP Ⅰ共转染肝癌细胞系HepG2细胞系, 并以pCAT3-SP Ⅰ单独转染HepG2细胞系作为对照,酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性. 结果:pCAT3-SPⅠ在HepG2细胞中能够启动CAT的表达; 共转染实验pCAT3-SP Ⅰ+pcDNA3.1(-)-ORM2组CAT 的表达活性较pCAT3-SP Ⅰ下降了81.9%. 结论:OKM2蛋白具有对HBV-SP Ⅰ的反式抑制作用.本实验验证了我室利用酵母单杂交技术筛选HBV-SP Ⅰ特异结合蛋白的结果,为进一步了解HBV-SP Ⅰ的转录调控机制及其与SP Ⅰ结合的反式作用因子提供了新的线索.

乙型肝炎表面抗原S-蛋白糖化位点序列的人工变异及其哺乳动物细胞表达产物的性状研究

利用末端重叠ＰＣＲ法和定点突变技术，获得了去除Ｎ－连接多糖结构的乙肝表面抗原Ｓ突变基因，将乙肝表面抗原Ｓ－蛋白中结合Ｎ－连多糖结构序列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ中的第１４８苏氨酸的密码子ＡＣＴ，改变为编码甘氨酸的密码子ＧＧＴ。构建了该突变基因的表达载体并在ＣＨＯ细胞中表达，筛选到两株表达水平较高的细胞系。对其中的一株细胞系Ｃ４１的表达产物做了初步纯化和鉴定。纯化样品经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，只含有２３ｋＤ一条蛋白带，而对照原基因ＣＨＯ细胞的表达产物则含有２３ｋＤ、２７ｋＤ和３０ｋＤ三条蛋白带，证实经人工修饰后其哺乳动物细胞表达产物不再含有糖基，纯化样品在电镜下可清楚地显示２２ｎｍ的球形颗粒。单克隆抗体反应谱分析发现，ＣＨＯ细胞表达的无糖ＨＢｓＡｇ与含糖ＨＢｓＡｇ的抗原表位存在明显差别。

乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄的遗传转化体系的建立

以丽春番茄无菌苗的子叶为外植体,以农杆菌菌株EHA105(包含质粒pBin438S)为载体,将乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄组织中.基本培养基采用MS+6-BA1 0mg/L+IAA0 2mg/L,在共培养时加入乙酰香酮100μmol/L作为诱导剂,经过组织培养得到转基因植株.对转化植株基因组进行的分子学PCR检测表明,外源基因有可能已整合到番茄基因组中.该转基因遗传体系的建立为利用转基因植物生产乙肝口服疫苗奠定了基础.

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].