HBV转录后调节序列变异位点的生物学意义初探

探讨HBV转录后调节序列位点变异与细胞因子介导的非细胞毒抗HBV机制的关系。应用定点突变技术,体外构建含有HPRE位点变异的重组质粒载体,观察位点变异对HPRE功能以及细胞因子抗HBV机制的影响。经测序证实,成功构建了含有HPRE变异位点的重组质粒载体。与野生株比较,1504nt突变株的CAT活性明显升高,差异有显著性意义;1508nt突变株则无明显变化。在IFN-γ或（和）TNF-α作用下,3种突变株的CAT活性均明显下降,在IFN-α作用下,1504nt突变株和1504+1508nt突变株的CAT表达活性明显降低,差异有显著性意义（P<0.01）;而1508nt突变株的CAT表达活性无明显变化（P>0.05）。提示HPRE1504nt位点的变异可能影响HPRE功能的发挥,而1508nt位点的变异可能逃逸了IFN-α的抑制作用。

HBV转录后调节序列抑制性结合蛋白的研究进展

HBV转录后调节涉及多个环节 ,其中 HBV转录后调节序列 ( posttranscriptional regulatoryelement,PRE)与宿主肝细胞核相应结合蛋白的结合是其中重要一环 ,二者的结合可促进转录体从细胞核向细胞浆的转运。PRE抑制性结合蛋白与 PRE结合能特异性抑制该环节。故 PRE结合蛋白特别是 PRE抑制性结合蛋白的研究 ,为抗 HBV感染提供了一个新的途径。

多聚嘧啶序列结合蛋白抑制HBV转录后调节元件的功能

目的探讨多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)对乙型肝炎病毒转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE)功能的影响。方法采用pDM138-HPRE CAT(chloramphenicol acetyltransferase)报告体系,通过质粒瞬时转染细胞的方式来探讨PTB对HPRE功能的影响。结果CAT活性检测表明:PTB的过表达使HPRE介导的CAT表达活性下降,并且呈剂量依赖性。当去除质粒上游剪接供体位点时,PTB仍然可以降低CAT的活性。结论PTB抑制HPRE的功能,并且这种抑制作用不依赖于上游剪接供体位点。

cAMP反应序列结合蛋白及其家族与转录调节

ｃＡＭＰ反应序列结合蛋白（ｃＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）经磷酸化激活后，可参与ｃＡＭＰ诱导的多种靶基因的转录调控。新近研究表明，ＣＲＥＢ的转录调节作用可能是通过ＣＲＥＢ结合蛋白（ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢＰ）实现的。在神经系统中，ＣＲＥＢ可能介导神经递质诱导的基因表达，并能通过放大神经营养因子的信号，参与神经细胞增殖、分化、存活等生物效应。

HBV转录后调节基序

乙型肝炎病毒(HBV)基因的表达调控是近年来HBV分子生物学研究的重点之一,对于了解HBV的致病机理、HBV与肝癌的关系以及对乙型肝炎和肝癌的预防和治疗均有重要的意义。HBV转录后调节基序就是新近发现的在转录后水平顺式调节HBV复制与表达的调控区域。

乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶蛋白反式调节基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)区蛋白的反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 以HBVDNA聚合酶RT基因的表达质粒pcDNA3 1( -) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行SSH分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶RT反式激活 ,故命名为DNA多聚酶反式激活蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HBVDNA聚合酶逆转录酶RT在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明RT蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。逆转录酶RT反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗?

HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究

目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3 1(-) X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3. 1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析。对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA 3 . 1(-) X的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实。结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740 5 2 0。该基因的编码序列全长为13 44个核苷酸(nt) ,编码产物由44 8个氨基酸残基(aa)组成。结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础。

乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶反式调节蛋白1基因的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法 以HBVDNA聚合酶逆转录酶表达质粒pcDNA3 .1( ) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶反式调节 ,故命名为DNA多聚酶反式调节蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 逆转录酶反式调节新靶基因DNAPTPl的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。

端粒酶逆转录酶活性的调节机制

具有酶活性的端粒酶主要由两部分组成:RNA组分(hTR)含有与端粒酶重复序列结合的模板区以及具有逆转录酶活性的蛋白催化亚基(hTERT)。hTERT的活化是诱导端粒酶活性的限速步骤。hTERT的调节涉及转录和转录后修饰、细胞内转移和核内装配等多环节。对hTERT调节机制的研究有助于对肿瘤发生机制的阐明及其治疗。

YMDD变异阴性的拉米夫定表型耐药患者体内乙型肝炎病毒逆转录酶基因序列分析

目的:了解YMDD变异阴性的拉米夫定耐药患者体内HBV逆转录酶基因变异情况.方法:采用PCR产物直接测序方法对3例YMDD变异阴性的拉米夫定耐药患者体内HBVRT区基因序列进行分析.结果:3份标本核苷酸变异率为0.24—0.85%,氨基酸变异率均为0.73%,较既往GenBank中收录的HBVC型基因序列的变异率无明显差别.发现以往已发表序列中未出现的新型变异-rtQ125N变异.结论:部分拉米夫定表型耐药现象的出现可能与HBVRT区基因变异无关.

抗HBV Pre S2 3B9单抗轻、重链可变区基因的分离,序列分析及单链可变区抗体基因的构建

3B9单抗是一株抗HBV PreS2抗原的单抗,为从分子水平分析,了解389单抗进而为制备新一代基因工程抗体奠定基础。本文用分子生物学技术,提取389杂交瘤细胞总RNA,经反转录,PCR分离获得了389单抗的轻,重链可变区基因。并利用PCR及双脱氧核苷酸链末端终止法对389单抗的可变区基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明,389单抗轻链隶属小鼠Ig

应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因

目的：乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV—S基因编码的具有多种功能的蛋白质。前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响。为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因，本实验应用基因芯片技术对于pcDNA3．1(-)和pcDNA3．1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析。方法：以含有HBV全基因组的质粒G．376—7(GenBank号：AF384371)作为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS2。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总mRNA，逆转录为cDNA．，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果：构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误，提取高质量的总mR—NA并进行逆转录成为cDNA，进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中，发现有42个基因表达水平显著上调，36个基因表达水平显著下调。结论：HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子，前-S2基因的表达对肝细胞基因表达谱有显著影响。

绝经后骨质疏松症患者外周血中GRP78和ATF4的表达水平及临床意义

目的探究绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMO)患者外周血中葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulated protein 78,GRP78)和激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的水平及临床意义。方法选取2018年12月—2021年5月石家庄市第三医院创伤骨科收治的96例PMO患者为PMO组,另选取同期96名体检健康的绝经女性为正常组。比较PM O组和正常组的一般资料;采用酶联免疫吸附法测定血清GR P78、ATF4水平;利用电化学发光免疫分析仪测定血清β-胶原特殊序列(β-Crosslaps)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(procollagenⅠtype N-terminal propeptide,PINP)水平;利用双能X线骨密度仪检测腰椎骨密度(bone mineral density,BMD);采用Pearson法分析PMO患者血清GRP78、ATF4水平与β-Crosslaps、PIN P、BM D的相关性及PMO患者血清GR P78表达水平与ATF4的相关性;用Logistic回归分析PMO发生的影响因素。结果PMO组患者腰臀比、BMD低于正常组(t=9.76、15.47,P均<0.001);血清GRP78、ATF4、β-Crosslaps、PINP水平高于正常组(t=18.32、16.81、8.15、14.84,P均<0.001);PMO患者血清GRP78、ATF4水平与β-Crosslaps、PINP均呈正相关(r=0.56、0.48、0.48、0.52,P<0.001、<0.001、<0.001、=0.006),与BMD呈负相关(r=-0.54、-0.44,P均<0.001);PMO患者血清GRP78水平与ATF4呈正相关(r=0.595,P<0.001);PINP、GRP78、β-Crosslaps、ATF4是影响PMO发生的危险因素(OR=2.518、2.672、2.271、2.336,P均<0.001),BMD是影响PMO发生的保护因素(OR=0.583,P<0.001)。结论PMO患者血清GRP78、ATF4水平较高,均与β-Crosslaps、PINP、BMD相关,GRP78、ATF4可能是诊治PMO的潜在靶标,测定血清GRP78、ATF4水平有助于临床防治PMO。

HBV感染基因封闭治疗中的两个研究热点

由于目前抗乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗效果并不令人满意,近年来一些学者提出了基因封闭治疗HBV感染的思路并进行了深入的研究。基因封闭涉及多个方面,其中反义技术和抑制性转录后调节序列结合蛋白是其中的两个主要部分,由于两者的高效性、高特异性和较强的可行性,使之成为现阶段基因封闭治疗研究中的两个热点。

胡萝卜WRKY69基因(DcWRKY69)的克隆及其对不同植物生长调节剂的响应

以胡萝卜品种‘黑田五寸’(Daucus carota var.sativa‘Heitian Wucun’)为研究对象,采用RT-PCR技术从叶片cDNA中克隆获得DcWRKY69基因片段,并对该基因及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;同时,采用RT-qPCR技术比较了0.1 mmol·L^-1茉莉酸甲酯(MeJA)、1.0 mmol·L^-1水杨酸(SA)、0.1 mmol·L^-1赤霉素(GA3)和0.1 mmol·L^-1脱落酸(ABA)处理12 h内叶中DcWRKY69基因相对表达量的差异。结果表明:DcWRKY69基因包含1个长度为783 bp的开放阅读框(ORF),编码260个氨基酸;DcWRKY69转录因子氨基酸序列在第52至第110位含有1个WRKY结构域,其锌指结构类型为C2 H2型,理论相对分子质量为30030,理论等电点为pI 4.78;该转录因子含有34个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构,亲水性氨基酸较多,且酸性氨基酸比例最高(27%);该转录因子的二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸链和随机卷曲组成,比例分别为21.92%、4.23%、11.92%和61.92%。序列比对和系统进化树分析结果表明:WRKY转录因子在植物进化过程中具有高度的保守性。RT-qPCR分析结果表明:经MeJA、SA、GA3和ABA处理后,DcWRKY69基因相对表达量的变化趋势不同,分别在处理后8、12、1和4 h达到峰值,且显著高于对照(处理0 h)。研究结果显示:DcWRKY69转录因子属于Ⅱ类WRKY转录因子,为亲水性蛋白,且可能属于非分泌蛋白;DcWRKY69基因可能参与胡萝卜对不同植物生长调节剂的响应过程,但其对不同植物生长调节剂的响应模式存在差异。

多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)与HBV转录后调节元件(HPRE)结合抑制HBV表面抗原的基因表达

采用RT-PCR验证PTB与HPRE在体外的特异性结合。用HepG2.2.15细胞系、HBs-HPRE瞬时转染Hela细胞探讨PTB对HBV基因表达的影响。结果显示PTB能与HPRE特异性地结合。功能性研究证明PTB可以抑制HepG2.2.15细胞的HBsAg表达量,并呈浓度依赖性。由HPRE引起的HBsAg表达的增加也能被PTB所抑制。实验数据证明PTB通过与HPRE相互作用抑制HBsAg的基因表达。

多聚嘧啶序列结合蛋白的表达、纯化及其与HBV转录后调节元件RNA结合的分析

目的在大肠埃希菌中表达并纯化多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract binding protein,PTB)-His融合蛋白,并鉴定PTB与HBV转录后调节元件(HBV posttranscriptional regulatory element,HPRE)RNA的体外结合。方法构建PTB-His融合蛋白的原核表达载体,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法进行纯化。用磁珠结合与Western印迹的方法,验证PTB与HPRE RNA在体外的特异性结合。结果成功构建了PTB-His融合蛋白的原核表达载体,并在体外大量表达后用亲和层析的方法得到了高纯度的PTB-His融合蛋白。磁珠结合沉淀与Western印迹实验证明PTB与HPRE RNA在体外能特异性的结合。结论体外表达的PTB融合蛋白能与HPRE RNA特异性的结合。

FoxP3^+T细胞在HBV感染中的作用

FoxP3,又名叉头状转录因子,是CD4＋CD25＋调节性T细胞（CD4＋CD25＋Treg）的特异性细胞内标志物,目前作为鉴别CD4＋CD25＋Treg的首选分子,以FoxP3＋T细胞或FoxP3＋Treg表示。Treg在抑制抗病毒T细胞免疫应答过程中发挥重要的作用。一方面,FoxP3＋Treg抑制过强的T细胞免疫应答避免对机体造成过度损伤;另一方面,由于限制了T细胞的抗病毒反应，病毒不能被及时清除而可能引起感染的持续存在。