环状RNA hsa_circ_0085576调控微小RNA-498/B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1轴对口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

目的探究环状RNA hsa_circ_0085576对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制。方法使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白印迹法检测OSCC细胞中hsa_circ_0085576、微小RNA-498(miR-498)以及B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒整合位点1(BMI-1)的表达水平。使用CCK-8、划痕实验、Transwell实验以及qRT-PCR、蛋白印迹法分别检测SCC-15细胞增殖活力、迁移及侵袭能力以及相关基因和蛋白的相对表达量。结果OSCC细胞中hsa_circ_0085576与BMI-1表达上调,miR-498表达下调(P<0.05)。下调hsa_circ_0085576表达或过表达miR-498后SCC-15细胞的增殖活性、划痕愈合率、侵袭细胞数目以及细胞周期蛋白D1、波形蛋白表达水平下调,miR-498和E-钙黏蛋白表达水平上调(P<0.05);抑制miR-498表达可减弱下调hsa_circ_0085576表达对OSCC细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用;上调BMI-1表达可减弱过表达miR-498对OSCC细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论下调hsa_circ_0085576表达可通过激活miR-498/BMI-1轴抑制OSCC细胞增殖、迁移及侵袭。

围绕品牌定位点实施品牌整合营销传播——以农夫山泉为例

我国很多企业的品牌营销传播缺乏个性特色,究其原因在于缺乏鲜明的品牌定位点,不能有效地以品牌定位为导向实施整合营销传播,受众对品牌的识别、感知和体验不深,品牌价值无法根植于顾客内心。文章选取农夫山泉这一知名的瓶装饮用水品牌,探讨其品牌定位点的开发,以及如何围绕品牌定位点实施品牌整合营销传播,从而获得品牌营销的成功。文章指出,品牌定位点是品牌传播的“魂”,应围绕这个“魂”来进行品牌传播,不论是传播内容的选取还是传播手段的运用,都要以品牌定位点为中心来进行。

整合位点分析技术的研究进展

慢病毒载体已被广泛用于将外源DNA转移到人类细胞中治疗各种遗传疾病。慢病毒载体可以整合到宿主基因组中,但整合位点通常不可预测,这可能会增加其治疗效果的不确定性。随着基因及细胞疗法的广泛应用,监管机构出台了一系列技术指导文件,以确保产品持续的安全性。整合位点分析(integration site analysis,ISA)是通过表征基因治疗载体的整合图谱来评估其生物安全性,也是转基因细胞进行克隆跟踪的关键工具。概述了用于逆转录病毒整合位点的技术演变,以及信息分析工具的优势和发展趋势,总结了减低病毒随机整合至基因组中的应对策略,以期为慢病毒载体的整合位点分析检测和细胞治疗产品新药临床试验安全性评估提供参考。

转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性.结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为:log2N(拷贝数)=-0.9354△Ct+3.4116(R2=0.9974,P<0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85±1.77和18.87±1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1(1440bp)、TgInS2(1263bp)和TgInS3(1861bp)3个整合位点.以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性.采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子.初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础.

转mCherry基因水稻的遗传分析及T-DNA整合位点的研究

为了建立转基因水稻的高通量遗传分析系统,本研究以粳稻成熟胚诱导的愈伤组织为受体材料,潮霉素磷酸转移酶(HPT)为抗性筛选标记,通过农杆菌介导的方法将红色荧光蛋白基因mCherry导入水稻。在水稻转化愈伤组织、转化植株(T0)和转基因后代(T1)均检测到红色荧光,证实mCherry在转基因水稻中稳定表达。139个独立转化株系的遗传分析表明,mCherry在转基因后代表现多种遗传模式,54%的转基因株系呈单位点遗传。TAIL-PCR进一步验证转基因整合到水稻基因组。根据T-DNA整合位点DNA序列分析结果,T-DNA左边界发生碱基缺失、增加和替换,右边界只发生碱基缺失,说明左边界比右边界有更多的碱基变异类型。此外,对T2代植株mCherry和HPT的转录水平进行实时定量逆转录PCR分析,结果表明,mCherry和HPT转录水平因T-DNA在水稻基因组中的整合位置而变化,表现位置效应。本研究在mCherry荧光蛋白和其它相关方法的基础上,为转基因水稻遗传及分子分析建立了一个高效的流程体系。

转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点分析

为获得转基因高油酸油菜T-DNA插入拷贝数及整合位点相关信息,本研究应用地高辛标记的NPTII基因片段为探针,与经BamHI酶切的转基因甘蓝型油菜高油酸株系W-4的T2代单株的基因组DNA进行Southern杂交。结果显示:W-4的T2代单株的基因组含有一个T-DNA拷贝。用3到4个根据载体pCNFIRnos序列设计的嵌套特异性引物分别与简并引物组合进行TAIL-PCR反应,扩增得到转基因油菜T-DNA插入位点的左、右边界旁侧序列。经分析右边界旁侧序列长度为470bp,其中180bp为载体序列,290bp为W-4的基因组序列;左边界旁侧序列长度为641bp,其中365bp为W-4的基因组序列,276bp为载体序列。序列比对结果发现该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无其他额外载体序列的整合。blast分析获得的与左右边界相连的油菜基因组序列,未检索到与之高度同源的序列,推测T-DNA插入位点可能位于油菜基因组非编码区。综上所述,本研究分析了转基因油菜W-4基因中T-DNA拷贝数、整合特点和旁侧序列,研究结果为转基因油菜的生物安全性评价以及转基因高油酸油菜的检测提供重要的基础信息。

piggyBac转座子在牛基因组的整合位点及特征分析

piggyBac(PB)转座子作为一种遗传工具被广泛应用于多个物种的转基因及插入突变研究,目前PB转座子在牛中的相关研究还较少。为了获得PB转座子在牛基因组中的整合位点,总结其转座特征,文章构建了PB[CMV-EGFP]和pcDNA-PBase二元转座系统,利用细胞核电转技术共转染牛耳组织成纤维细胞,经G-418筛选,获得了稳定转染EGFP的转基因细胞系;提取细胞基因组DNA,利用基因组步移技术扩增PB转座子5′Bac区插入位置的DNA序列;通过与牛基因组序列进行BLAST比对,得到PB转座子在牛基因组中的插入位点。文章共获得了8个有效的整合位点,但仅有5个位点定位到染色体1、2、11和X染色体上。序列分析表明:在牛基因组中,PB转座子可特异性的插入到"TTAA"位置,并整合到基因间的非调控区;分析整合位点"TTAA"相邻一侧的5个碱基组成,发现PB转座子5′端倾向于插入到GC(62.5%)碱基富集区。该研究表明,PB转座子可以在牛基因组中发生转座,获得的整合位点信息为利用PB转座子在牛上开展遗传学研究提供了理论参考。

piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac(PB)转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT(58.35%)碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC(57.8%)。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。

甘蓝型油菜茎高QTL定位及株高相关位点整合

甘蓝型油菜主茎高度(茎高)是株型的构成因子之一,研究其遗传机理对油菜株型改良具有重要的理论指导意义。目前对甘蓝型油菜茎高研究的报道较少。本研究以2个油菜茎高差异较大的亲本构建的重组自交系群体为材料,利用SNP高密度遗传图谱,2年共检测到11个茎高QTL,分布在A04、A06、C04、A08和C01染色体上,位点的表型贡献率为7.25%~19.61%。同时,以455份来源不同的甘蓝型油菜为材料,结合重测序产生的SNP标记,对茎高进行全基因组关联分析,2年共检测到5个SNP与茎高性状显著关联,分布在A08、A10、C02和C06染色体上。根据茎高定位结果,找到一些与激素途径(生长素、赤霉素和油菜素内酯)、光形态建成及植物生长发育相关的候选基因。在此基础上,结合国内外株高相关性状定位研究结果,将株高相关性状位点整合到甘蓝型油菜参考基因组上,发现4个以上群体都在A01、A03、A07、C03和C06染色体上找到株高定位的区间,2个群体在A10染色体上找到主花序长度共同定位的区间,在A02和C03染色体上找到一次分枝高度共同定位的区间。本研究中的茎高定位结果与整合后的株高相关性状QTL定位区间有部分重叠,位于A04、A06、A08、C04和C06染色体上。上述结果为甘蓝型油菜理想株型育种提供了理论依据。

HIV-1整合酶四聚体结构模拟及其活性位点分析

HIV-1复制需要HIV-1整合酶将其环状DNA整合进宿主DNA中,这其中包括2个重要反应,即"3′-加工"和"链转移",两者均由HIV-1整合酶催化完成.阻断其中的任一反应,都能达到抑制HIV-1复制的目的.因此,了解HIV-1整合酶的完整结构和聚合状态,对深入探讨其作用机理及设计新型抑制剂具有重要的指导作用.然而,迄今为止仅有HIV-1整合酶单独结构域的晶体结构可供参考,而其全酶晶体结构尚未获得解析.本研究利用分子模拟技术,通过蛋白质-蛋白质/DNA分子对接、动力学模拟等方法,构建了全长整合酶四聚体的结构模型、HIV-1DNA与整合酶复合物的结构模型,进一步从理论上证实HIV-1整合酶是以四聚体形态发挥催化作用,明确"3′-加工"和"链转移"在HIV-1整合酶上的催化位点.同时,通过与作用机理相似的细菌转座子Tn5转座酶等的结构比对,推测HIV-1整合酶的核心结构域中应有第2个Mg2+存在,其位置螯合于Asp64与Glu152之间.在HIV-1整合酶结构研究的基础上,有望进一步设计出新的抗艾滋病药物.

转基因动物整合位点的研究进展

转基因动物整合位点克隆及相关序列特征研究是探索外源基因整合机制和整合稳定性的重要手段。转基因整合位点序列的克隆方法主要有:个体基因组文库筛选法、反向PCR法、热不对称交互式PCR法和质粒回收法。4种方法各有优缺点,可根据不同条件选用。克隆到的整合位点序列表明,整合位点可能存在一定的共同特征。

原核注射法转基因猪外源基因整合位点的分布及其遗传规律

应用非同位素标记染色体原位杂交技术 ,对 9头不同世代的转 OMT- PGH基因猪和 6头原代转 h DAF基因猪外源基因整合位点的分布及其遗传规律进行了研究。结果表明 ,4头原代转 OMT- PGH基因猪外源基因分别整合在第7、13、2和 8号染色体上 ,6头原代转 h DAF基因猪外源基因分别整合在第 13、6、11、2、7和 7号染色体上 ,证实了用原核注射法转基因猪外源基因的整合是“随机”的。来自同一亲本、不同世代的 5头转 OMT- PGH基因猪 ,其外源基因均存在于第 13号染色体上 ,与共同祖先原代转基因猪的整合位点相一致 ,表明转基因猪外源基因可以传递给后代 。

禽痘疫苗病毒中网状内皮组织增生病病毒5′LTR整合位点序列分析

参照国外发表的禽网状内皮组织增生病病毒（REV）5’长末端重复序列（LTR）在禽痘病毒（FPV）疫苗株基因组上的整合位点及相关序列，合成一对来自FPV的引物，从国内5个不同厂家生产的禽痘疫苗中经PCR均扩增到REV-5’LTR。通过序列比较发现，我国5个FPV疫苗毒株中REV-5’LTR整合位点与美国和澳大利亚的天然重组禽痘疫苗完全一致。其中，有3个的REV-5’LTR插入序列也与美国的Vac-3-Am株和澳大利亚的Vac-M3-Au株有100％的同源性。另2个中国疫苗毒株中的REV．LTR插入序列与美国疫苗毒株Vac-1-A。中的REV-LTR插入序列有99．6％的同源性。但是，这5个中国禽痘疫苗毒株中整合的REVLTR与中国近年分离到的REV野毒株HA9901的5’LTR的同源性只有75．4％-92．4％。

多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定

GFP47是一个利用双元载体pPZP111构建的绿色荧光蛋白基因的简单质粒载体pPZP-GFP经农杆菌介导转化陆地棉(Gossypiumhirsutum L.)获得的T0株系,PCR和Southern杂交分析证实其不仅整合了多个拷贝的正常的T-DNA,而且有紧邻T-DNA左边界的载体骨架序列的整合。对来源于GFP47的33个T1个体的PCR分析表明,T1后代中可以分离只有正常T-DNA整合的个体。对T1群体中不同基因型个体的Southern杂交分析结果显示,该多拷贝整合的T0转化体至少在棉花基因组中有四个插入位点,不同的Southern带型暗示不同插入位点的T-DNA结构和排布有很大的不同。至少有一个位点整合了只包括目的基因和选择标记基因在内的正常T-DNA结构。

фC31位点特异性整合酶系统研究进展

介绍了фC31重组酶作用机制、фC31整合酶在基因治疗及其转基因动物研制中的应用、фC31整合酶催化效率的影响因素,以及фC31整合酶整合的安全性。实验证实,фC31-int可作用于多种动植物细胞及组织,将目的基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效地表达。近年来该酶在哺乳动物体内和体外的研究进展表明,фC31整合酶已经成为研究转基因、基因治疗及基因修饰的一种重要工具。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3整合位点的鉴定

目的:确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在宿主菌基因组中的整合位点。方法:利用在噬菌体PaP3基因组中无酶切位点的Pst Ⅰ对溶原性细菌全基因组进行酶切,获得含有噬菌体PaP3全基因组及部分宿主菌DNA序列的大片段;然后进行第二次酶切,获得噬菌体基因组与宿主菌基因组的交界点序列,并进行克隆、测序,鉴定出杂合位点attR。根据λ噬菌体的整合机制,利用PCR反应扩增出另一杂合位点attL,根据测序结果及Blast检索确定attP 与attB的位置和DNA序列。结果:经序列比对发现,attP及attB的核心位点分别位于噬菌体PaP3基因组中的 t-RNAPro基因及铜绿假单胞菌PA3基因组中的t-RNALys基因中,其核心位点的DNA序列为21 bp(5'-GGTCGTAGGT- TCGAATCCTAC-3')。在核心位点的两侧存在正向重复序列及反向重复序列。结论:该研究为铜绿假单胞菌噬菌体的整合酶及整合机制的研究奠定了基础。

位点特异整合酶φC31的作用机制及应用

链霉菌噬菌体φC31整合酶是一种位点特异整合酶(Site-specific recombinase,SSR),其能够精确并单向的促进attP位点与attB位点的重组,是继Cre/Loxp、FLP之后又一个倍受关注的位点特异整合酶,该整合酶已经成为基因治疗、转基因研究等领域的常用技术手段。现对φC31位点特异性整合酶的作用机制、整合位点及其在转基因和基因治疗中的应用进行了综述,并对其发展前景进行了展望。

解整合素-金属蛋白酶33基因位点多态性与哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠综合征的相关性研究

气道高反应是支气管哮喘的高危因素或是支气管哮喘的前期表现,如果支气管哮喘得不到控制,则会出现气道重塑、肺功能下降,进一步发展出现慢性阻塞性肺疾病的病理改变及临床特点,后期即成为哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠综合征（ACOS）。哮喘和气道高反应性被认为是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的危险因素,在我国2013年COPD诊治指南中已明确提出。

φC31整合酶系统介导的位点特异性整合研究进展

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体φC31的整合酶可介导链霉菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)之间的同源重组,这种重组亦可在多种动植物细胞内进行;而且,该整合酶还可介导含attB位点的载体以位点特异性方式整合于多种真核生物基因组内的假attP位点,并使转基因持续高效表达。因此,φC31整合酶在基因修饰、基因治疗及转基因动物研制等方面得到了广泛的应用。文章就近年来φC31整合酶整合规律、提高效率方面的改进及安全性等相关领域的研究进展进行了综述。