HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO_2细胞内的稳定表达

目的构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达。方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞。通过RT-PCR和Westernblot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达。结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBXmRNA在靶细胞中的表达,Westernblot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达。结论成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型。

水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞体外抑制作用研究

目的研究水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞的体外抑制作用。方法以液氮快速冻融法制备水蛭提取物,以常规水提醇沉法水蛭提取物作对照,不同浓度体外干预人肝癌HepG2细胞,MTT法检测两种水蛭提取物对HepG2细胞增殖的抑制作用,并进行细胞计数,吖啶橙荧光染色法检测细胞凋亡情况。结果水蛭液氮快速冻融法提取物药物浓度为6～15mg/mL时,对人肝癌HepG2细胞的增殖有明显抑制作用,细胞数目明显下降,并呈剂量依赖性,与水提醇沉法提取物比较,差异有统计学意义(P<0.01)。吖啶橙染色可见典型的凋亡细胞形态学特征。结论水蛭液氮快速冻融法提取物可体外抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,其作用明显优于水蛭水提醇沉法提取物。

钙结合蛋白S100A13在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的:探索钙结合蛋白S100A13(S100 calcium binding protein A13,S100A13)在肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其临床意义。方法:收集广西医科大学第一附属医院34例HCC及相应癌旁组织、18例正常肝组织标本,商业购置197例肝癌及相应癌旁高密度组织芯片。应用原位RT-PCR技术检测HCC组织、癌旁组织、正常肝组织中S100A13 mRNA的表达,使用免疫组织化学技术检测HCC组织、癌旁组织、正常肝组织中S100A13蛋白的表达,并用Image-ProPlus软件分析免疫组织化学光密度值。结果:S100A13 mRNA在HCC、相应癌旁和正常肝组织中表达的阳性率分别为70.21%、51.06%和33.33%;S100A13 mRNA定位主要在胞核,多表达于核膜。S100A13蛋白在HCC、相应癌旁和正常肝组织中表达的阳性率分别为55.84%、38.96%及26.32%,HCC组织中的平均D值最高(0.038±0.051),其次是癌旁组织(0.022±0.034),正常肝组织(0.01±0.009)最低(P<0.05);S100A13蛋白主要表达于HCC细胞的胞质中,部分细胞核偶见表达,此外在癌旁次生胆小管中及部分炎细胞中也存在高表达。S100A13蛋白在HCC中的表达与患者的性别、年龄及病理分级无关。结论:HCC组织高表达S100A13蛋白,S100A13可能具有作为肝癌治疗靶点的潜力。

细胞因子诱导杀伤细胞灌注治疗原发性肝癌临床应用

目的探讨肝动脉细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)灌注+超液化碘油栓塞治疗原发性肝癌的疗效。方法采用超选择段性肝动脉灌注CIK细胞+超液化碘油栓塞治疗原发性肝癌及经皮肝穿刺瘤体内多点注射CIK细胞共38例(研究组);将同期采用常规剂量经肝动脉段性化疗栓塞(C-TACE)联合经皮肝瘤体内注入无水乙醇80例(双介入组);单纯经皮肝动脉常规剂量C-TACE134例(单纯组)相比较。结果研究组、双介入组和单纯组近期显效率分别为76.3%、41.3%和14.9%,研究组的AFP降至正常及明显下降率则显著高于双介入组和单纯组,3组血清AFP变化差异有统计学意义(P<0.01)。结论采用超选择段性肝动脉灌注CIK细胞+超液化碘油栓塞综合治疗原发性肝癌,可以提高患者的免疫功能、生存质量,延长带瘤生存期。

HBx和CEACAM1在乙肝相关性肝癌中的表达及意义

目的:探讨HBx和癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)在乙肝相关性肝癌中的表达及意义。方法:采用免疫组织化学方法(SP法)检测81例乙肝相关性肝癌组织中HBx及CEACAM1的表达情况,分析HBx和CEACAM1与乙肝相关性肝癌的临床病理特征。Western blot检测人正常肝细胞系QZG、肝癌细胞HepG2及稳定转染HBx的肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中CEACAM1的表达。结果:81例乙肝相关性肝癌组织中HBx表达阳性率为74.07%(60/81),CEACAM1表达阳性率为71.60%(58/81),二者与门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期存在显著相关,HBx与CEACAM1的表达呈负相关(rs=-0.310,P<0.01);在HepG2-X中,CEACAM1蛋白表达水平与肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞系QZG相比显著降低。结论:HBx的高表达和CEACAM1的低表达与乙肝相关性肝癌的侵袭、转移密切相关,HBx有可能通过抑制CEACAM1的表达而诱导乙肝相关性肝癌的侵袭与转移。

三种CT扫描方法显示肝癌清晰度及癌变范围的评价

本文通过前瞻性研究,对一组原发性肝癌病人分别进行CT平扫、常规增强和延迟增强(简称DICT)扫描。结果表明:DICT扫描较平扫和常规增强扫描显示更多的病变;DICT显示癌变的清晰度优于平扫和常规增加;DICT较平扫和常规增强扫描更为准确地反映癌瘤侵犯的范围。

T-cadherin启动子甲基化与人肝癌T-cadherin表达的关系

目的:探讨T-cadherin启动子甲基化与T-cadherin在肝细胞癌中表达的关系.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specificPCR,MSP)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹(Westernblot)检测T-cadherin在肝细胞癌中启动子甲基化的状态及其对T-cadherin表达的影响.培养肝癌HepG2细胞,采用去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine处理后,Westernblot检测T-cadherin表达,并观察T-cadherin表达对肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.结果:T-cadherin在肝细胞癌中存在启动子甲基化(40%),肝细胞癌组织中T-cadherin启动子甲基化导致其表达明显下调(表达评分:0.227±0.875vs0.188±1.667,P<0.05);对存在T-cadherin启动子甲基化的HepG2细胞应用去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine培养能诱导HepG2细胞T-cadherin分子的重新表达,T-cadherin分子重新表达能抑制HepG2细胞增殖.结论:T-cadherin启动子的甲基化导致其表达下调;去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine能恢复HepG2细胞T-cadherin的表达,并抑制HepG2细胞增殖.

苍耳亭抑制肝癌HepG2体内外药效研究

目的通过体外肿瘤细胞抑制实验及体内抗肿瘤实验,探讨苍耳亭体内外抗人肝癌细胞HepG2的作用。方法体内通过构建裸鼠肝癌自发转移模型,并随机分成空白对照组、苍耳亭低、高剂量组,连续腹腔注射2周,完整剥离肿瘤组织,称取瘤质量,计算抑瘤率,并且剥取主要脏器,计算脾指数与胸腺指数;体外通过MTT、Transwell实验初步观察苍耳亭对癌细胞侵袭迁移的作用。结果体内实验结果显示苍耳亭低剂量组与高剂量组的抑瘤率分别为17.61%和39.57%,具有较好的抑制肿瘤活性(P<0.05,P<0.01),并且高低剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。体外苍耳亭抑制HepG2细胞增殖效果明显,与空白对照组DMSO比较,16μM时诱导肿瘤细胞凋亡差异有统计学意义(P<0.01),其IC 50值为29.04μM。同时,Transwell实验显示也能抑制体外癌细胞侵袭。结论苍耳亭体内外对肝癌HepG2细胞均具有较强的抑制作用,具有浓度依赖性。

WWOX与STAT3在肝细胞癌组织中的表达及相关性分析

目的探讨WWOX和STAT3在人肝细胞癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系，并分析两者之间的相关性。方法应用免疫组织化学法检测60例肝细胞癌组织和癌旁组织中WWOX和STAT3的表达情况。结果WWOX在60例肝细胞癌中的阳性表达率为35．00％，显著低于癌旁组织中的表达（70，00％）（P〈0．05）。STAT3在肝细胞癌中的阳性表达率为71．67％，明显高于癌旁组织（36．67％）（P〈0．05）。WWOX蛋白表达与临床分期、肿瘤直径、肿瘤细胞分化密切相关（P〈0．05）；STAT3的表达与脉管癌栓、术后复发、肿瘤直径、肿瘤细胞分化密切相关（P〈0．05）。WWOX和STAT3蛋白的表达呈显著负相关（r=-0．392，P：0．002）。结论WWOX失活和STAT3高表达可能在肝细胞癌的发生及进展中有重要作用。

肝动脉栓塞化学治疗84例中晚期原发性肝癌患者的疗效

目的:评价肝动脉栓塞化学治疗中晚期原发性肝癌的疗效和毒副反应。方法:对84例中晚期原发性肝癌患者采用肝动脉栓塞化疗,化疗2次以上评价疗效。结果:完全缓解(CR)0例,部分缓解(PR)14例,稳定(NC)40例,进展(PD)30例,总有效率为16.7%(14/84),临床获益率为66.7%(54/84)。全组患者3个月、半年、1年、2年、3年、4年、7年生存率分别为100%(84/84)、64.2%(54/84)、20.23%(17/84)、13.1%(11/84)、8.33%(7/84)、5.95%(5/84)、1.19%(1/84),其中1例生存7年者是巨块型肝右叶癌患者,为栓塞化疗5次联合瘤体内无水乙醇注射3次。主要毒副反应为发热、骨髓抑制及消化道反应。结论:肝动脉栓塞化疗是中晚期肝癌的有效治疗手段,联合经皮肝癌瘤体内无水乙醇注射法可提高疗效。

肝移植治疗原发性肝细胞癌的进展

肝移植已经成为治疗肝癌的重要手段。选择合适的病人是一个重要的问题,国际通行的是米兰标准,我国一般公认的适应证主要包括:合并有肝硬变失代偿、不能接受肝切除治疗的小肝癌患者和肿瘤多发且波及左右两叶、肝功能严重损害、行切除术后肿瘤容易复发或出现肝功能衰竭者。血管侵犯,细胞分化程度等因素可以影响治疗的预后。围手术期辅助治疗(经皮肝动脉化学栓塞、经皮无水酒精瘤内注射、射频消融,氩氦刀治疗)对于提高肝移植的疗效有一定的意义。

Gd-DTPA增强磁共振成像在诊断肝细胞肝癌中的价值

目的：评价Gd-DTPA增强磁共振成像在诊断肝细胞肝癌中的价值。资料与方法：经手术病理或临床证实的肝细胞肝癌53例行磁共报检查，成像序列为：自旋回波T1WI，脂肪抑制PD、T2WI及Gd-DTPA增强T1WI（T1WI＋C）。总结各序列图像对病体、子灶、假包膜、肿瘤镶嵌样结构、门静脉瘤栓等结构显示率。结果：T1WI、T2WI、T1WI＋C对病体的显示率分别为66％、100％、66％，显示的子灶数分别为28、52、22个，假包膜的显示率为39％、43％、75％，对肿瘤镶嵌样结构的显示率分别为20％、62％、73％，对门静脉瘤栓的显示率各为25％、100％、31％。结论：Gd-DTPA增强MRI对肝细胞肝癌的定性诊断有一定的帮助，而在确定主瘤、子灶、与门脉瘤栓存在与否方面不如T2WI。Gd-DIPA增强在肝细胞肝癌诊断中应选择使用而不必作为常规序多列。

肝细胞肝癌组织中促红细胞生成素受体的表达及其与微血管密度的相关性研究

目的探讨肝细胞肝癌(HCC)微血管密度(MVD)与促红细胞生成素受体(EPOR)表达之间的关系,以及此二者与临床病理学特征之间的关系。方法应用免疫组织化学法检测46例HCC、20例肝硬化和10例正常肝组织内EPOR的表达情况,观察与HCC病理学特点及MVD之间的关系。结果(1)EPOR及MVD值在HCC中的阳性表达率和强度显著高于肝硬化和正常肝脏组织(P<0.05);(2)EPOR在有包膜侵犯组、低分化组及有转移HCC中的阳性表达率及强度明显高于无包膜侵犯组(χ2=6.40,P<0.05;)、高中分化组(χ2=12.03,P<0.01);以及无转移组(χ2=5.62,P<0.05);(3)肝癌>5cm、有包膜侵犯、有转移、低分化组的MVD值明显高于肝癌≤5cm(t=2.82,P<0.05)、无包膜侵犯(t=3.91,P<0.05)、无转移(t=4.10,P<0.05)及高中分化组(t=5.12,P<0.05);(4)EPOR阳性表达HCC中的MVD值明显高于EPOR阴性表达HCC中的MVD值(t=5.43,P<0.05)。结论EPOR在HCC组织中的表达上调与其血管生成和浸润转移有关。

丹参酮ⅡA对人肝癌细胞HepG2生长的抑制及诱导凋亡的研究

目的研究丹参酮ⅡA对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及诱导其凋亡的作用,探讨丹参酮ⅡA抑制肿瘤的作用机制。方法将丹参酮ⅡA配制成0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L的浓度,0μg/L为阴性对照。将肝细胞在不同浓度的丹参酮ⅡA中培养24 h、48 h、72 h,采用MTT法检测丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2的抑制情况,流式细胞仪检测细胞的周期和凋亡情况。结果相同的浓度,随着时间延长,吸光度逐渐下降,而同一时间,随着浓度的增加,吸光度也逐渐下降。相同浓度,随着时间的延长,丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2生长的抑制率逐渐增加,相同时间,随着浓度的增加,丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2生长的抑制率也逐渐增加。随着丹参酮ⅡA浓度的增加,G0/G1的比例逐渐升高(2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL),与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着丹参酮ⅡA浓度的增加,细胞凋亡率逐渐升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2的生长具有抑制作用,且具有时间和浓度依赖性,对凋亡的诱导作用具有浓度依赖性。

^(32)P-玻璃微球治疗原发性肝癌的临床研究

目的:探讨^(32)p-玻璃微球(^(32)P-GMS)综合化疗栓塞治疗中晚期原发性肝癌的临床效果。材料与方法:1995年6月～1999年6月,32例中晚期原发性肝癌分为2组,第一组16例,系^(32)P-GMS综合化疗栓塞组,首先注入^(32)P-GMS超液化碘油悬浮液,然后注入3联化疗药,最后用明胶海绵颗粒栓塞第二组16例,系单纯化疗栓塞组。结果:^(32)P-GMS综合化疗栓塞组16例中,9例肿瘤缩小大于50％,6例AFP降至正常,12例生存超过24个月,肿瘤缩小率及AFP下降率两组比较均有显著差异性。^(32)P-GMS综合组12个月、18个月和24个月生存率分别为87.5％、81.0％、75.5％,而单纯化疗栓塞组分别为56％、31％、18.7％,统计学处理亦有显著性差异。结论:^(32)p-GMS是治疗中晚期原发性肝癌可行的内放射性核素之一,采用^(32)P-GMS综合化疗栓塞是提高治疗原发性肝癌患者生存率的有效方法。

三氧化二砷抑制人肝癌细胞侵袭性的体外研究

目的:研究三氧化二砷(As2O3)对人肝癌SMMC-7721细胞侵袭能力的影响,为As2O3用于原发性肝癌的治疗提供实验依据。方法:以0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml的As2O3与人肝癌细胞株SMMC-7721孵育24、48和72h后,应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)观察As2O3对细胞生长的影响;应用Transwell小室进行人工重组基底膜侵袭和运动实验,观察As2O3对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果:应用As2O3处理后人肝癌SMMC-7721细胞生长受到抑制,且有时间-浓度依赖性;同时肝癌细胞过膜细胞数减少,侵袭能力受到抑制。结论:As2O3在体外能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和侵袭能力,且有浓度依赖性。

肝细胞癌患者血清血管内皮细胞生长因子和基质金属蛋白酶-9的水平变化及其意义

目的:检测肝细胞癌患者血清血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9含量并分析与临床分期的相关性。方法:用ELISA法检测30例健康对照者和146例肝细胞癌患者血清血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9含量,分析血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9对肝细胞癌的诊断价值和临床分期的关系。结果:肝细胞癌组血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9水平显著高于健康对照组水平(P<0.01)。肝细胞癌患者血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9水平与肿瘤大小呈正相关(P<0.01),肝细胞癌术后转移和复发患者血清血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9水平明显升高(P<0.05),TNMⅢ、Ⅳ期患者血清血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9水平也明显高于I、Ⅱ期患者(P<0.01)。结论:血清血管内皮生长因子与基质金属蛋白酶-9测定可作为诊断肝细胞癌和临床分期的重要指标。

CEACAM1表达与乙肝相关性肝癌微血管生成的关系

目的:探讨癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)在乙肝相关性肝癌中的表达与微血管生成的关系。方法:采用免疫组织化学方法(SP法)检测81例乙肝相关性肝癌组织中CEACAM1及CD105的表达情况,分析CEACAM1和CD105标记的MVD与乙肝相关性肝癌临床病理特征的关系。结果:81例乙肝相关性肝癌组织中CEACAM1表达阳性率为71.60%(58/81),CD105在本组肝癌组织中的阳性表达率为100%(81/81),CEACAM1及CD105-MVD分别与肿瘤直径、包膜浸润、门静脉侵袭、淋巴结转移和TNM分期密切相关(P<0.05),其中CEACAM1阳性组MVD值与阴性组间差异具有统计学意义(t=3.588,P=0.001),CEACAM1阴性组MVD值较高。结论:乙肝相关性肝癌中CEACAM1的表达下调可能参与肿瘤微血管生成,提高其侵袭及转移能力。

Quercetin调节肝癌HepG2细胞PTEN基因表达诱导细胞凋亡的实验研究

目的探讨三磷酸肌醇(IP3)和PTEN基因表达变化在quercetin诱导肝癌细胞凋亡中的作用。方法以肝癌HepG2细胞为空白对照,以不同浓度quercetin作用于HepG2细胞不同时间后,应用同位素试剂盒检测细胞IP3含量,RT-PCR分析PTENmRNA表达,Western blotting分析细胞PTEN蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果各浓度的quercetin作用于肝癌HepG2细胞,IP3含量显著低于对照组(17.9±1.5、15.5±1.1、5.7±0.9、5.5±0.8vs29.4±0.5),PTENmRNA表达与对照组无显著差异,PTEN蛋白表达显著高于对照组(0.55±0.02、0.67±0.02、0.94±0.04、0.95±0.03vs0.02±0.002),细胞凋亡率显著高于对照组。60μmol/Lquercetin作用于肝癌HepG2细胞6h、12h、24h、48h、72h,各时相IP3含量显著低于对照组(23.3±1.4、12.0±1.4、7.5±0.8、5.6±0.5、4.3±0.6vs29.2±0.6,P<0.01)。PTENmRNA表达与对照组无显著差异,12h后各时项PTEN蛋白表达显著高于对照组,24h后各时相细胞凋亡率为显著高于对照组(P<0.01)。结论Quercetin能减少IP3生成,上调PTEN蛋白,诱导肝癌细胞凋亡。

IL-2和γ-IFN对晚期肝癌患者淋巴细胞粘附肿瘤细胞能力的影响

目的 研究重组 ＩＬ－ ２（ｒＩＬ－２）和 γ－ＩＦＮ对晚期肝癌患者淋巴细胞粘附肿瘤细胞能力的影响。方法 晚期肝癌患者２４例，用 ｒＩＬ－２和 γ－ＩＦＮ预培养患者外周血淋巴细胞 ４ｈ，采用肿瘤淋巴细胞花环试验测定淋巴细胞粘附肿瘤细胞直接接触效应与活性．结果 ｒＩＬ－２对正常人和肝癌患者的淋巴细胞免疫粘附肿瘤能力都有明显的的提升效应，但单独使用 ｒＩＬ－２对肝癌患者淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞的提升效应较差，ｒＩＬ－２与γ－ＩＦＮ联合使用可显著增强淋巴细胞对肿瘤细胞的免疫粘附功能．结论 肝癌患者淋巴细胞免疫粘附肿瘤细胞能力明显低下，ｒＩＬ－２与γ－ＩＦＮ联合使用具有协同刺激肝癌患者淋巴细胞活性之作用．