HBVx转基因小鼠肝组织基因表达谱的微阵列研究

目的 研究乙肝病毒 (HBVx)和黄曲霉毒素(AFB1)在诱发肝癌中的分子机理。方法 用AtlasTM cDNA表达阵列方法比较研究HBVx基因转基因小鼠HBVx基因整合 (+)和 (- )的小鼠肝组织 ,以及转基因小鼠经AFB1一次攻击的肝癌组织的基因表达谱的差异。结果 经HBVx基因整合 (+)的小鼠肝组织的DNA修复基因 ,药物代谢酶基因以及应激反应的效应因子的cDNA基因表达谱显示了明显的变化。实验结果提示出现变异的 30个cDNA基因表达谱中 2 9个 (96 .7% )与X基因的整合相关及 17个 (5 6 .7% )与AFB1的攻击有关。结论 HBV对宿主的感染 ,可能通过改变DNA修复系统和药物代谢酶系统来影响机体对AFB1的致癌敏感性 。

慢性乙肝患者HBVx-DNA表达与mIL-2R相关性

目的探讨慢性乙肝、原发性肝癌患者乙肝病毒x基因(HBVx-DNA)表达水平与膜白细胞介素-2受体(mIL-2R)的相关性。方法采用聚合酶链反应检测慢性、原发性肝癌乙肝患者血清中HBVx-DNA,采用生物素-链霉亲和素(BSA)法检测患者外周血单个核细胞(PBMC)用植物血凝素(PHA)诱导前后mIL-2R表达水平。结果慢性乙肝、原发性肝癌患者HBVx-DNA阳性率分别为11.9%(16/135)和40.9%(9/22),2者相比差异有统计学意义(P<0.01)。其中慢性乙肝轻度、中度、重度、肝炎后肝硬化患者血清HBVx-DNA阳性率分别为0,20.8%(5/24),17.9%(5/28),17.1%(6/35),差异有统计学意义(P<0.01)。HBeAg(+)组HBVx-DNA阳性率为20.4%(21/103),与HBeAg(-)组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。HBVx-DNA(+)组和HBVx-DNA(-)组PHA诱导前后mIL-2R表达水平分别为(2.53±1.08)%,(26.47±4.26)%和(3.34±1.23)%,(29.25±4.71)%,2者相比差异均有统计学意义(P<0.01)。肝活组织检查,原发性肝癌患者HBVx-DNA阳性率达50%(3/6),明显高于慢性乙肝和肝炎后肝硬化患者。结论慢性乙肝患者体内有HBVx-DNA存在,以中度、重度及肝炎后肝硬化患者较多见。原发性肝癌患者体内HBVx-DNA表达水平均最高,其与宿主细胞整合是导致原发性肝癌发生的重要原因。HBVx-DNA(+)患者T细胞活化功能进一步降低,可能是诱导原发性肝癌发生的另一重要原因。HBVx-DNA检测对原发性肝癌早期发现和辅助诊断具有重要意义。

HBVx基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的：研究乙型肝炎病毒 Ｘ 基因在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞凋亡的影响。方法：用分子生物学的方法构建 Ｈ Ｂ Ｖｘ 基因真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ，用脂质体将真核表达载体ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３１ Ｈ Ｂ Ｘ转染入肝癌细胞 Ｈ Ｃ Ｃ９２０４ ， Ｇ４１８ ５００ ｍｇ· Ｌ－ １ 筛选，获得稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的细胞，阿霉素２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 诱导细胞凋亡。电镜、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测凋亡细胞。结果：２０ μｍｏｌ· Ｌ－ １ 阿霉素可诱导肝癌细胞凋亡，稳定表达 Ｈ Ｂｘ 蛋白的肝癌细胞凋亡率比未进行基因转染的肝癌细胞凋亡率低。结论： Ｈ Ｂｘ 蛋白可抑制阿霉素诱导的肝癌细胞调亡。

原发性肝癌患者HBVX基因与内分泌激素相关性的初步研究

为了解原发性肝癌（HCC）患者的内分泌激素水平与HBVX基因间的相互关系，探讨HBV相关性HCC发生中内分泌激素的作用，用聚合酶链反应技术-限制片段长度多肽性分析法（PCR－RFLP）检测48例原发性肝癌患者血清HBVX基因，并与用放射免疫法（RIA）检测的血清睾酮（T）、雌二醇（E2）、生长激素（HGH）、泌乳素（PRL）、C肽水平进行相关分析。结果表明，HBVX基因阳性原发性肝癌患者血清HGH水平显著高于阴性组（t=3．38，P＜0．01）；T水平显著低于阴性组（t=2.24，P＜0．05）。HBVX基因阳性肝癌患者C肽水平与E2高度正相关（r=0．861，P＜0．01），与T正相关（r=0．380，P＜0．05）；血清HGH水平与E2正相关（r=0．471，P＜0．05）。结果提示：HGH、T、E2水平的改变与HBV相关性HCC发生有关；其中E2、胰岛素和HGH可能有协同作用。

慢性乙肝、原发性肝癌患者HBVx-DNA表达水平及其临床意义

[目的]探讨慢性乙肝、原发性肝癌患者HBVx-DNA表达水平及其临床意义。[方法]用聚合酶链反应对157例慢性乙肝及原发性肝癌患者血清和外周血单个核细胞(PBMC)中HBVx-DNA进行检测。[结果]慢性乙肝、原发性肝癌患者HBVx-DNA总阳性率分别为18.5%(25/135)和63.6%(14/22),两者相比差异有显著性(P﹤0.01)。慢性乙肝及原发性肝癌患者血清和PBMC中HBVx-DNA阳性率分别为11.9%(16/135)、6.7%(9/135)和40.9%(9/22)、22.7%(5/22)。两者相比差异有显著性(P﹤0.01和P﹤0.05)。其中慢性乙肝轻度、慢性乙肝中度、慢性乙肝重度、肝炎后肝硬化患者血清内HBVx-DNA阳性率分别为0%、20.8%(5/24)、17.9%(5/28)、17.1%(6/35),相互比较差异有显著性(P﹤0.01)。慢性乙肝轻度、慢性乙肝中度、慢性乙肝重度、肝炎后肝硬化患者PBMC内HBVx-DNA阳性率分别为0%、8.3%(2/24)、10.7%(3/28)、11.4%(4/35),相互比较差异无显著性(P﹥0.05)。HBeAg(+)组HBVx-DNA总阳性率为30.1%(31/103),与HBeAg(-)组相比,差异有显著性(P﹤0.05)。其中HBeAg(+)组和HBeAg(-)组血清HBVx-DNA阳性率为20.4%(21/103)和7.4%(4/54),差异有显著性(P﹤0.05);HBeAg(+)组和HBeAg(-)组PBMC内HBVx-DNA阳性率为9.7%(10/103)和7.4%(4/54),差异无显著性(P﹥0.05)。AFP(+)组患者HBVx-DNA阳性率为63.6%(14/22),与AFP(-)组患者相比,差异有显著性(P﹤0.01)。[结论]原发性肝癌患者血清和PBMC内HBVx-DNA表达水平均较高,HBVx-DNA与宿主细胞整合可能是导致原发性肝癌发生的重要原因。慢性乙肝患者体内有HBVx-DNA存在,以慢性乙肝中度、重度及肝硬化患者多见,应警惕有诱发原发性肝癌的可能。AFP与HBVx-DNA表达水平具有高度相关性,HBVx-DNA检测对原发性肝癌早期发现和辅助诊断具有重要意义。

HBVx在肝细胞癌中的研究进展

肝细胞癌（HCC）的发生和发展与HBVX蛋白（HBx）的多种生物学功能密切相关,但HBV与原发性肝癌之间的特异关系仍未完全阐明,HBV慢性感染肝细胞的过程为HBV DNA整合于肝细胞DNA之中[1-2],如果其DNA整合在肝细胞DNA的原癌基因附近,可导致这些原癌基因的激活[3].因此,HBx及其编码基因的研究可揭示HCC发生和发展的机制.通过分析病毒基因组转化活性和病毒DNA推测,病毒DNA自身具有病毒癌基因,并且发现其产物x蛋白或HBx Ag具有反式激活功能.随着HBVx基因（HBx）研究的不断深入,同时还发现其可与抑癌基因产物P蛋白相互作用[4-5].HBx基因及其产物在原发性肝癌发生过程中起着十分重要的作用[6-7].对HBx的全面了解,将有助于对HBV致癌机理的认识.

HBVx蛋白的生物学功能特点

由 HBV x基因编码的 HBV x蛋白 (HBx)是一种多功能蛋白 ,不仅具有广泛的转式激活功能 ,而且可以通过许多复杂途径参与细胞的凋亡、DNA修复的调控、与 P53 的相互作用以及促进细胞周期的进程等。因此HBx与病毒本身的复制以及宿主细胞的转录、增生、转化和凋亡有着密切的关系。

肝硬变患者内分泌激素与HBVX基因相关性的初步探讨

研究表明,HBVX基因在HBV全基因中有三个直接重复顺宇和两个反转重复顺序共五对保守的重复顺序,表明Ⅹ基因在HBV基因中占有很重要的地位;HBVX基因已成为研究的热点。但是,在评价HBVX基因的生物学作用时,应综合考虑机体激素-内分泌网络的整体效应,本文将分析肝硬变患者血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、生长激素(HGH)、泌乳素(PRL)及HBVX的相关性,初步探讨肝硬变形成中乙型肝炎病毒感染、内分泌激素的综合作用。

HBVX蛋白和DNAP在肝癌组织中的表达

乙型肝炎病毒(HBV)感染与肝细胞癌(HCC)发生关系密切,但其确切机理尚不清楚,近年来 HBV 致癌研究重点在有关 X 基因及其编码的 X 蛋白(HBVX)和 P 基因编码 DNA 聚合酶(DNA Polymerase,DNAP)上,并发现 X 基因和 P 基因的翻译产物是HBV 致癌过程中的重要因素。因此本文应用HBVX 和 DNAP 多克隆抗体对60例 HCC,

HBVX蛋白及血管生成素-2与乙型肝炎相关性肝细胞癌的关系研究

目的探讨HBVX蛋白(HBVX protein,HBx)及血管生成素(angiopoietin,Ang)-2与乙型肝炎(乙肝)相关性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展的关系。方法采用免疫组化S-P法检测69例乙肝相关性HCC组织中HBx和Ang-2的表达,并分析它们与患者临床病理学特点的关系。结果 69例乙肝相关性HCC组织中HBx的阳性表达率为84.06%(58/69),Ang-2的阳性表达率为81.16%(56/69)。HBx的表达与HCC的淋巴结转移及门静脉侵犯有关(P<0.05),Ang-2的表达与HCC的肿瘤直径、包膜浸润、淋巴结转移、门静脉侵犯及TNM分期有关(P<0.05)。HBx与Ang-2在乙肝相关性HCC组织中表达呈正相关(rp=0.600)。结论 HBx可能参与乙肝相关性HCC的新生血管形成,这可能与Ang-2的高表达有关。

HBVX蛋白与基因调控和肿瘤形成的关系

乙型肝炎病毒X蛋白是乙型肝炎病毒基因组的四个开读框架之一 ,X ORF编码一分子量约为 17kD ,约含有 15 4个氨基酸的蛋白质。实验证实PX是一种反式作用因子 ,能与细胞内多种与转录、基因调节有关的因子结合 ,广泛激活病毒和细胞的启动子 ,参与基因调控 ,与HBV慢性感染后所形成的肝细胞肿瘤密切相关。PX本身不具有直接结合双链DNA的能力 ,它主要是通过蛋白与蛋白间的相互作用来行使功能 ,其中包括直接与一般转录因子和有关转录调节的蛋白形成复合物和激活细胞内的信号传递途径两种方式。本文就这方面的有关研究概况作以综述。

原发性肝癌患者HBVX基因与性激素及C肽水平的相关性实验探讨

乙型肝炎病毒(HBV)的Ⅹ基因与HCC高相关性已引起人们的重视,这主要与HBVX基因能编码具有反式激活作用的Ⅹ蛋白有关。已有研究表明,Ⅹ蛋白在HBV复制。

原发性肝癌检测HBVX蛋白的临床价值

目的:研究原发性肝癌检测HBVX蛋白的临床价值。方法:采用聚合酶链反应(PCR)检测血清中乙型肝炎病毒X基因。结果:100例原发性肝细胞癌(PHC)HBVX蛋白阳性51例(51%),34例肝硬化(LC)HBVX蛋白阳性12例(35.3%),28例慢性肝炎(CH)HBVX蛋白阳性7例(25%)。47例X蛋白阳性血清中HBV标志物HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性40例(85.1%),其中PHC患者占28例(59.6%)、LC患者占9例(19.1%)、CH患者占3例(6.3%)。HBV标志物均阴性的血清中,PHC患者50例HBVX蛋白阳性19例(38%)、LC患者29例HBVX蛋白阳性5例(17.3%)、CH患者11例HBVX心明眼亮白阳性2例(18%)。在51例HBVX蛋白阳性原发性肝癌患者中,其中Ⅰ期46例(91.2%),Ⅱ期4例(7.8%),Ⅲ期1例(%),Ⅳ期0例(0),在46例HBVX蛋白阳性的原发性肝癌Ⅰ期患者中有9例在影像学发现之前出现。34例肝硬化(LC)HBVX蛋白阳性12例(35.3%),28例慢性肝炎(CH)HBVX蛋白阳性7例(25%)。经追踪调查,12例HBVX蛋白阳性的肝硬化患者有4例发展为肝癌,7例HBVX蛋白阳性的慢性肝炎患者中,有2例发展为肝癌。结论:HBVX蛋白是癌基因的启动因子,是导致PHC发生的主要原因。

中国高发区肝细胞癌中HBVx基因的广泛存在及与p53基因249密码子高频率点突变的密切关联

目的乙肝病毒（ＨＢＶ）是肝细胞癌（ＨＣＣ）的主要病因。ＨＢＶ中的ｘ基因被认为是它的癌基因。为确定ｘ基因在肝癌癌变中的重要性，我们主要针对ＨＢｓＡｇ阴性的ＨＣＣ，研究ＨＢＶｘ基因的存在、表达和突变的情况；同时也对ｘ基因与ｐ５３基因２４９密码子热点突变的相关性进行了分析。方法应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和ＤＮＡ序列分析方法，重点针对１９９１年～１９９６年在启东和北京手术的、病理确诊为ＨＣＣ的２５个血清ＨＢｓＡｇ阴性病例进行研究。结果ＰＣＲ显示２５个血清ＨＢｓＡｇ阴性和１９个血清ＨＢｓＡｇ阳性的ＨＣＣＤＮＡ中无一例外地存在ＨＢＶｘ基因序列。随机抽取血清阴性标本中的８例，均检出ＨＢＶｘ基因在ＲＮＡ水平上的表达。序列分析ＨＢＶｘ基因显示６例中有４例的ｘ基因在１３０、１３１密码子存在错义点突变。应用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ，确定了启东５７％（１２／２１）的ＨＢ－ｓＡｇ阴性病例的ＨＣＣＤＮＡ中，ｐ５３的２４９密码子也发生了错义点突变，而北京的４例标本中未见上述突变。结论ＨＢＶｘ基因序列广泛存在于启东ＨＢｓＡｇ阳性及阴性的ＨＣＣ标本中，表明它在肝癌发生中必不可缺的地位。启东ＨＣＣ中ＨＢＶｘ基因都与ｐ５３基因热点突变关?

感染HBVx的肝前体细胞的小鼠体内稳定表达模型构建

为了探究HBVx是否累及其他组织器官,本研究构建了携带HBVx基因的慢病毒表达载体,感染14-19肝前体细胞,使其能稳定表达HBVx基因,并构建了门静脉动物模型,使肝前体细胞在小鼠体内存活并能够进一步分化,并在不同时间段分别检测小鼠各个组织中HBVx目的基因的表达情况。通过PCR扩增HBVx目的基因,使之与逆转录病毒表达载体(p Lenti-CMV-HA-3FLAG-PGK-EGFP-F2A-Puro)连接,后通过酶切、菌落PCR、测序验证质粒是否构建成功。构建成功后用携带HBVx逆转录病毒感染14-19肝前体细胞,嘌呤霉素(puromycin)连续筛选4周后进行细胞HBVx目的基因检测。同时进行门静脉动物模型构建,分别在第3天、7天、14天、30天、60天进行检测小鼠各个组织器官中的HBVx的表达情况。成功构建携带HBVx的慢病毒表达质粒、稳定携带HBVx的14-19肝前体细胞、门静脉动物模型。同时检测了各个组织器官HBVx的表达情况,HBVx可在肝脏内生长分化且可在肝脏内长时间高表达,其余组织不表达。携带HBVx的肝前体细胞可在肝内生长分化,且HBV具有嗜肝性,不累及其他脏器。构建了一个长期表达HBVx的动物模型,为本课题组后续研究HBVx导致肝癌发生发展奠定了良好基础。

原发性肝癌患者肝组织中乙型肝炎病毒X蛋白与P53蛋白的结合

癌抑制基因p53发生突变是导致肝癌发生的重要因素之一。突变的p53基因表达的p53蛋白稳定性提高易被检出。作者前已报道,免疫组织化学分析10例肝癌标本中HBx蛋白基因全部阳性,但p53蛋白仅有2例阳性。设想高度表达的HBx蛋白有可能在肝组织中与p53蛋白作用形成复合物。为了证实此设想,本文分别用抗HBx单克隆抗体和抗p53单克隆抗体作免疫沉淀和免疫印迹分析表明,在肝癌患者肝组织中HBx蛋白可与p53蛋白作用产生复合物,可能影响p53基因的抑癌功能。此为HBx蛋白在肝癌发病中起重要作用的一个方面。

乙肝x基因在原发性肝癌中表达的临床研究

目的 通过对 HBx Ag在 HBs Ag阳性的原发性肝癌中的表达研究 ,进一步了解 HBVx基因在原发性肝癌发生发展与转归中的作用。方法 对 HBx Ag在原发性肝癌及其转移灶组织中的表达进行免疫组化检查 ,同时采用聚合酶链反应法 (PCR)和酶联免疫吸附法 (EL ISA )检测病人血中的 HBVDNA、HBe Ag,了解 HBx Ag在原发性肝癌组织中表达与肝癌分期及 AFP表达的关系 ;并将结果进行统计分析。结果 HBx Ag在肝癌单发灶组 ( 组 )病人阴、阳性表达分别为 8/ 2 8、2 0 / 2 8例 ;在肝癌伴肝内转移灶组 ( 组 )病人阴、阳性表达分别为 6 / 32、2 6 / 32例 ;肝癌病人外周血中的 HBVDNA在 组和 组阳性数分别为 5 / 2 8、7/ 32例 ,HBe Ag在 组和 组阳性数分别为 7/ 2 8、10 / 32例 ;HBx Ag的阳性表达数 ,在临床 、 、 期病人中分别为 1/ 5、19/ 2 2、2 6 / 32 ,在大小肿瘤中阳性表达数分别为 4 2 / 4 8、4 / 12 ,在 AFP阴阳性表达组中阳性表达数分别为 13/ 16、33/ 4 4。结论 乙肝 x基因与原发性肝癌及转移灶中癌的发生发展有一定的关系 ,与病人预后判断也有一定的关系 ,但其表达的高低不能作为肝癌转移倾向的预测指标。