HBx蛋白抑制乙型肝炎病毒诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素的研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)对Ⅰ型干扰素表达的影响,并进一步探讨相关机制。方法:以HepG2细胞和稳转HBV基因组的HepG2.2.15细胞为模型,转染针对乙型肝炎病毒X(HBx)基因的小干扰RNA(siRNA)[HBx-siRNA]至HepG2.2.15细胞,转染HBx蛋白表达质粒pEGFP-HBx至HepG2细胞,荧光定量PCR技术分析各细胞中的IFN-α、IFN-β mRNA含量,荧光显微镜观察HepG2细胞内质粒pEGFP-HBx的表达,Western blot技术分析各细胞中HBx和p-IRF3蛋白含量变化,以探讨HBV通过HBx蛋白对Ⅰ型干扰素表达的影响。结果:IFN-α和IFN-β mRNA在HepG2.2.15细胞中的含量略高于HepG2细胞,差异无统计学意义(P>0.05);RNA干扰抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达后,细胞中IFN-α、IFN-β mRNA含量显著升高,转染pEGFP-HBx的HepG2细胞中Ⅰ型干扰素的基因表达量和p-IRF3的蛋白表达量均降低。结论:HBV通过HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化,从而抑制Ⅰ型干扰素的表达。

HBx蛋白对α干扰素诱导的MxA蛋白表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)HBx蛋白(HepatitisB virus X protein)对α干扰素(IFN-α)诱导的抗病毒蛋白的影响及相关机制。方法以表达HBx蛋白的重组质粒FL1-145HBx转染人肝胚瘤细胞株HepG2细胞,经IFN-α处理后,RT-PCR法分析细胞内抗病毒蛋白MxA和JAK-STAT信号转导途径分子STAT1 mRNA表达水平,同时运用免疫印迹检测细胞内HBx、p-ERK、p-STAT1和t-STAT1等蛋白的表达。结果转染细胞内MxA、STAT1的mRNA和p-STAT1、t-STAT1的蛋白表达水平明显减少(P<0.05);而ERK抑制剂PD98059预处理后,转染细胞内MxA、STAT1 mRNA水平能够恢复至转染前的表达水平。结论 HBx蛋白很可能通过影响IFN-αJAK-STAT信号转导途径分子而抑制抗病毒蛋白MxA的表达;ERK信号转导途径的活化可能参与这一抑制过程。

乙型肝炎病毒X基因及HBx蛋白的研究进展

我国是乙型肝炎高发区,乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子,在乙肝的致病过程中起到重要作用。HBx可直接或间接改变肝脏结构细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡;具有广泛的非特异性反式激活作用,反式激活细胞内的某些癌基因或病毒基因,与乙型肝炎和肝细胞癌的发生关系十分密切。本文从多方面综述了X基因及HBx蛋白目前的研究进展,展现了X基因功能的多样性。

HBx蛋白与Hepsin共表达可促进HBV复制

运用RT-PCR技术从原发性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)患者的癌旁组织中扩增了Hepsin基因编码区序列,该序列已被克隆并构建了pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒和表达HBx蛋白的载体共转染HepG2.2.1.5细胞,观察HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用对HBV病毒复制和病毒蛋白表达的影响。研究结果表明共表达HBx蛋白、Hepsin蛋白可以协同提高HBV病毒颗粒在培养液中的拷贝数,并提高HBV病毒蛋白HBs、HBe的表达水平。这说明HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用可以增强HBV病毒的复制。

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制TTRAP启动子活性的体外研究

旨在探讨体外培养条件下HBx蛋白对TTRAP(TRAF and TNF receptor-associated protein)基因转录水平表达的影响。用RT-PCR及Real-time PCR检测TTRAP在HepG2细胞和HepG2.2.15细胞中的表达;构建TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒;分别与HBV、HBs、HBp、HBc、HBx表达质粒共转染HepG2细胞,比较虫荧光素酶活性。RT-PCR和Real-time PCR结果显示,TTRAP在HepG2.2.15细胞中的表达量分别是其在HepG2细胞中表达量的44.9%和27.8%(P<0.05)。TTRAP启动子虫荧光素酶报告质粒与HBV表达质粒共转染组的相对荧光素酶活性,与对照组相比下降了43.8%。转染HBx表达质粒组的相对荧光素酶活性与其对照组相比下降了35%,而转染HBc、HBs及HBp表达质粒组对相对荧光素酶活性没有影响。因此证实HBx蛋白能抑制TTRAP启动子活性。

HBx蛋白的生物学效应

HBx是乙型肝炎病毒 (HBV)的X开放读码框架所编码的具有多种调控功能的病毒蛋白质。HBx通过激活宿主细胞和病毒自身基因的转录 ,调控细胞凋亡 ,抑制细胞中受损DNA的修复以及激活细胞中MAPK、JNK等的信号转导通路等多种调控作用 ,直接或间接地对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程产生广泛的影响。

HBx蛋白激活肝细胞表达的FasL的生理效应

目的 :观察HepG2细胞表达的FasL蛋白的生理效应 ,期望能进一步阐明乙型病毒性肝炎的分子发病机制。方法 :(1)建立转染HBx基因的HepG2细胞系。(2)HepG2x细胞表达的FasL生理效应的分析:采用细胞混合培养后 ,测定LDH释放、DNALadder及流式细胞仪方法检测细胞凋亡情况。结果 :HepG2x细胞可表达FasL,HepG2x细胞与HepG2o、Jurkat细胞混合培养48小时后 ,HepG2o及Jurkat细胞特异性LDH释放率均等于零。DNAladder及流式细胞仪检测APO2.7抗体标记细胞结果表明 ,与HepG2x混合培养后 ,HepG2o、Jurkat细胞发生凋亡 ;增强HepG2o细胞表达Fas ,细胞凋亡程度也增加。结论

CytoTrap酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒HBx蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒HBx蛋白发生相互作用的肝细胞蛋白。方法构建诱饵重组载体pSos-HBx,经测序正确后将其转化酵母菌cdc25Hα中,检测其在酵母中的表达及有无自激活作用,并利用CytoTrap酵母双杂交的方法筛选与诱饵蛋白HBx相互作用的肝细胞蛋白。结果获得重组诱饵质粒pSos-HBx,验证可以在酵母中表达诱饵蛋白Sos-HBx,且诱饵质粒在此系统中没有自激活作用。利用此系统筛选出6个能与HBx相互作用的肝细胞蛋白,分别为纤连蛋白1、翻译调控肿瘤蛋白1、核受体结合蛋白IQ-WD1、软泡抑素、血清类粘蛋白1、二硫化物异构酶家族A3。结论成功克隆出乙型肝炎病毒HBx蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBx蛋白在肝炎或肝癌过程中发挥的作用提供了新线索。

乙肝相关肝细胞癌中HBx蛋白的作用机制

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一,同时也是排列全球第三位的肿瘤相关致死原因[1]。其发病率在我国仅次于肺癌,居第二位。我国每年约33万人死于肝癌,死亡率极高[2]。另据统计,全球范围内约53%的肝癌病例与乙肝相关[3]。同样有研究证明,乙肝病毒表面抗体(HBs Ag)携带者相对于未感染者而言,其罹患肝癌的风险高出25~37倍[4,5]。

一种与HBx蛋白相互作用未知蛋白抗体的制备及其应用

本研究构建UK蛋白的原核表达载体pET28-UK,转化BL21宿主菌,经过IPTG诱导、表达、纯化,获取UK蛋白,制备抗原,免疫杭州大耳白兔.经过3次免疫后心脏采血,吸取血清作为抗体.经过ELISA和免疫荧光试验验证,该抗体可以识别机体UK蛋白.本研究为深入阐明HBx与UK蛋白的相互作用的功能性试验,以及完全阐明UK蛋白在细胞内的功能奠定了基础.

乙肝HBx蛋白对转录因子Nrf1表达影响的研究

目的研究乙肝HBx蛋白对转录因子Nrf1表达的影响。方法通过TCGA分析,转染HBx重组质粒,运用RT-qPCR和WB实验检测HBx对Nrf1表达的影响;免疫组化实验分析肝癌临床病例组织乙肝感染对Nrf1表达的影响。结果TCGA分析结果提示HBV阳性组织Nrf1低表达。转染HBx重组质粒诱导Nrf1低表达,HepG2.2.15细胞Nrf1低表达。HBV阳性临床肝癌组织Nrf1低表达,癌组织相比癌旁组织Nrf1低表达。结论乙肝HBx蛋白下调转录因子Nrf1的表达。

乙肝病毒HBx蛋白抑制索拉非尼诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙肝病毒HBx蛋白对索拉非尼诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将空载质粒pEGFP-N1、目的质粒pEGFP-N1-HBx扩增,转染HepG 2细胞,G418筛选抗性克隆,并用RT-PCR检测细胞中HBx表达以表明建立稳定表达细胞株HepG 2/GFP-HBx。用索拉非尼(5μmol/L)分别处理HepG 2、HepG 2/GFP、HepG 2/GFP-HBx细胞,CCK-8计算不同时间点的抑制率;流式细胞检测处理48 h后凋亡率。结果 pEG-FP-N1-HBx经PCR验证扩增成功,RT-PCR显示HepG 2/GFP-HBx细胞有HBx基因转录表达。CCK-8表明索拉非尼处理的3组细胞均发生了明显的时间依赖性细胞凋亡,流式细胞检测显示索拉非尼处理48 h后,HepG 2、HepG 2/GFP细胞凋亡率分别为32.76%、32.80%明显高于HepG 2/GFP-HBx(16.92%)(P<0.01);未处理组细胞凋亡率为3.72%、4.40%、3.85%,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立了稳定表达GFP、GFP-HBx的HepG 2细胞模型;HBx能够抑制索拉非尼诱导的HepG 2细胞凋亡。

人肝癌细胞株HepG2中原钙粘附蛋白10基因异常甲基化及其与HBx蛋白的关系

目的研究原钙粘附蛋白10(PCDH10)启动子在人肝癌细胞株HepG2中的甲基化状态及与HBx调控的相关性。方法用逆转录PCR(RT-PCR)和甲基化特异性聚合酶链反应(MSP),检测去甲基化药物5-氮-2'-脱氧胞苷(Aza)联合组蛋白乙酰化酶抑制剂TSA(trichostatin A)处理前后,HepG2细胞中PCDH10基因的表达及启动子甲基化水平;用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)定位检测发生甲基化的CG位点。用MSP检测表达HBx基因的重组腺病毒感染HepG2细胞后PCDH10基因的表达及甲基化水平。结果 PCDH10基因在HepG2细胞株中表达沉默,其启动子发生明显甲基化,Aza可以部分去除PCDH10甲基化从而上调其mRNA表达水平。但HBx蛋白表达不影响HepG2细胞中PCDH10的甲基化程度。结论 PCDH10启动子异常甲基化使HepG2细胞内转录沉默,但其甲基化状态与HBx蛋白表达无关。

乙肝病毒MHBs^t/HBx蛋白对Galβ1,3GalNAcα2,3-唾液酸转移酶的反式激活作用

PCR方法扩增乙肝病毒MHBst、HBx基因片段 ,构建真核表达载体pcDNA3 1 MHBst 和pcDNA3 1 HBx。PCR方法从肝细胞基因组中扩增出Galβ1,3GalNAcα2 ,3 唾液酸转移酶 (ST3GalI)的启动子Psial,用Psial取代pEGFP N1的启动子pCMV构建pEGFP N1 Psial。利用磷酸钙 DNA共沉淀的方法 ,将pcDNA3 1 MHBst、pcDNA3 1 HBx分别与pEGFP N1 Psial瞬时共转染至正常肝细胞QGY 770 1。流式细胞仪分析细胞平均荧光密度值发现 ,MHBst、HBx分别将ST3GalI启动子的活性上调了 35 2 %和 43 8%。研究了乙肝病毒MHBst、HBx对ST3GalI的转录调控作用 。

HBx蛋白抑制DKK4表达的机制及对肝癌细胞系增殖和迁移的影响

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白下调DKK4的机制及对肝癌细胞系增殖和迁移能力的影响。方法将编码乙型肝炎病毒X蛋白的腺病毒(Ad-HBx)分别感染肝癌细胞系HepG2和SMMC7721细胞,同时设感染GFP腺病毒(Ad-GFP)为对照组,用去乙酰化酶抑制剂(TSA)处理肝癌细胞系,并用小干扰RNA-组蛋白去乙酰化酶1(si-HDAC1)及过表达DKK4的慢病毒转染肝癌细胞系。Western blot检测DKK4、HDAC1及SIRT1的表达情况。MTT实验、结晶紫实验和Transwell实验分别检测肝癌细胞系的增殖和迁移能力。结果Ad-HBx感染肝癌细胞系后DKK4蛋白表达水平下降(P<0.05),TSA处理后DKK4蛋白表达水平回复(P<0.05)。Ad-HBx感染肝癌细胞系后,HDAC1及SIRT1蛋白水平显著升高(P<0.05)。小干扰RNA沉默HDAC1后能够恢复DKK4的表达(P<0.05),沉默HDAC1和(或)过表达DKK均能抑制肝癌细胞系的增殖和迁移能力(P<0.05)。结论乙型肝炎病毒X蛋白通过上调HDAC1、SIRT1来抑制DKK4的表达,沉默HDAC1及过表达DKK4蛋白表达能够抑制感染Ad-HBx肝癌细胞系的增殖和迁移能力。

HBx蛋白对启动和维持感染后病毒复制必不可少

乙型肝炎病毒的分子生物学已被广泛研究，但在自然感染乙型肝炎病毒x（HBx）蛋白的确切作用尚不清楚。

HBx蛋白致癌作用方式的新进展

乙肝病毒(HBV)的慢性感染可致肝硬化和肝癌,严重危害着人类身体健康。其X基因编码的蛋白——乙肝病毒X蛋白(HBx)通过与细胞内大量分子的相互作用,参与甚至决定着该过程。本文对近两年来该领域的研究进展作一综述。 1 HBx的性质、分布 HBx是HBV上的X基因编码的16.5KD的分子,有能够与多种蛋白分子发生作用但必须部位相同的氨基酸序列。Fukai等在研究HBV的基因组启动子I时。

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。