以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建

目的 构建以HBVHBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒 ,以探讨HBV基因免疫的新途径。方法 PCR扩增HBc第 1～ 72aa及 93～ 183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheⅠ /XhoⅠ位点 ,构建真核表达载体pHBcdM。合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点 ,构建HBc Mep融合基因真核表达质粒。经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒。结果 双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约 885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因。结论 成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc Mep ,为研究pHBc Mep作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。

稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株的筛选与鉴定

目的建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株。方法将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS-1细胞,经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株,并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果筛选所得稳定表达细胞株经RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应,而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株,命名为NS/HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。

对携带HCC表位的HBc病毒样颗粒负载的DC疫苗的免疫评价

目的:探讨携带肝细胞癌(HCC)表位的嵌合蛋白颗粒HBc-VLPs负载小鼠BMDCs制备的DC疫苗,免疫小鼠后诱导抗原特异的细胞免疫应答和抗肿瘤效应。方法:制备HLA-A2转基因小鼠来源的BMDCs,将三种带有高表达于HCC的HLA-A2限制的CTL表位的HBc-VLPs、三种抗原表位肽和不含HCC表位野生HBc-VLPs分别负载HLA-A2转基因小鼠BMDCs制备成DC疫苗,阴性对照组用PBS替代。将HLA-A2转基因小鼠分为四组,分别免疫上述DC疫苗并对其免疫效果进行评价:体外检测抗原特异性淋巴细胞内IFN-γ的产生和CTL细胞活性并观察不同方法处理的DCs对肿瘤生长的抑制情况。结果:与其他组相比,HBc-VLPs负载的DCs免疫小鼠后第8天,流式细胞仪即可检测到分泌IFN-γ的CD8+T细胞存在;用LDH法检测到较强的抗原特异性CTL活性;在肿瘤接种后的20天之前均未见到明显的肿瘤块,具有显著抗肿瘤作用。结论:利用携带HCC抗原表位的HBc-VLPs负载DCs后得到可强烈诱导免疫活性和明显抗肿瘤作用的DC疫苗,为DC疫苗的优化和评价提供了实验方法,也为进一步深入研究新型肝细胞癌治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。

乙型肝炎病毒颗粒性抗原转基因番茄植株的构建及鉴定

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)颗粒性抗原转基因番茄植株。方法将乙型肝炎病毒preS/S基因插入到HBc的第73～94aa处(棘突尖部),再把整个复合基因克隆到植物表达载体pBIN438(含35s起动子)中,通过液氮冻融法转化根瘤农杆菌eha105,采用叶盘法转化番茄。结果得到一批转基因番茄植株,经PCR、PCR-Southernblot和Souhternblot证实HBc-HBs基因已整合到番茄基因组中;经Westernblot证实HBc-HBs能在番茄中有效表达。结论成功构建了乙肝颗粒性抗原基因的转基因番茄植株,为下一步进行该番茄疫苗株的效果评价奠定了基础。