基于β-环糊精的阿霉素纳米HBc-VLPs的制备与性能评价

通过重组的乙肝核心蛋白病毒样颗粒(HBc-VLPs)对阿霉素进行包封已经被证实有良好的靶向缓释效果,但是载药量和稳定性方面仍待提升,本文基于β-环糊精(β-CD)建立一种有效的HBc-VLPs-β-CD-DOX制备方法,利用高效液相、粒径、透射电镜等方式评价HBc-VLPs-β-CD-DOX的表征、载药量、稳定性以及乳腺癌细胞的抗肿瘤活性。结果显示,HBc-VLPs-β-CD-DOX呈球形,粒径为(30±2)nm左右,大小形态均一,其载药量可达250μg/mL,相较于HBc-DOX-VLPs有明显提升,粒径结果显示HBc-VLPs-β-CD-DOX在4°C的环境下可存放30d,动态透析法显示HBc-VLPs-β-CD-DOX在生理状态下有较好的稳定性,DOX的泄漏率不到1%,细胞毒性结果显示,HBc-VLPs-β-CD-DOX对于4T1细胞的有较好的杀伤作用,IC50可达到1.128μg/mL。研究结果表明,HBc-VLPs-β-CD-DOX制备成功并建立了高效的包封方法,表现出良好的保存稳定性和生理稳定性以及对肿瘤细胞的杀伤效果,是一种非常有前景的纳米靶向药物。

由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究

目的:构建以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e流感通用疫苗(Flu@u V),利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,进行初步的蛋白表达及纯化。在此基础上,构建DNA流感通用疫苗。方法:利用全基因合成的序列为模板,成功构建HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE、Western blot和电镜检测其表达。将纯化的蛋白与弗氏佐剂共同免疫小鼠,取小鼠外周血进行流式细胞分析。通过荧光分析和Western blot初步验证DNA流感通用疫苗在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达情况。结果:成功表达纯化了HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白,经电镜观察到30nm左右的蛋白纳米颗粒样结构。小鼠外周血流式细胞分析显示HBc和3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力,而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。通过荧光检测和Western blot检测说明DNA流感通用疫苗在真核细胞中成功表达。结论:成功构建HBc与甲型流感病毒HA和M2e的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了重要基础。

HBc-VLP的分子动力学模拟和结合自由能计算

乙型肝炎核心病毒样颗粒HBc-VLPs(Hepatitis B Core Antigen Virus-like Particles)因稳定性好且易于改造,被作为疫苗载体广泛使用,但影响VLPs稳定性的控制机制尚不清楚。采用分子动力学模拟研究了HBc-VLP中蛋白亚基二聚体、五聚体及六聚体复合物的稳定性,计算了体系中蛋白亚基的介电常数,避免了以往研究中直接使用经验参数的做法;通过分子力学-泊松玻尔兹曼溶剂可及表面积(MM-PBSA)方法计算亚基分子间的结合自由能,表明范德华作用能和非极性溶剂化作用能有利于促进相邻蛋白亚基间的亲和作用;根据计算结果可推测HBc-VLPs中六聚体比五聚体的稳定性更强,而两个六聚体之间或五聚体同六聚体之间形成的二聚体有助于进一步形成结构更加稳定的HBc-VLPs。该结论有助于生物工程中对HBc-VLPs的蛋白质改造,从而提高HBc-VLPs为载体的候选疫苗的稳定性。

对携带HCC表位的HBc病毒样颗粒负载的DC疫苗的免疫评价

目的:探讨携带肝细胞癌(HCC)表位的嵌合蛋白颗粒HBc-VLPs负载小鼠BMDCs制备的DC疫苗,免疫小鼠后诱导抗原特异的细胞免疫应答和抗肿瘤效应。方法:制备HLA-A2转基因小鼠来源的BMDCs,将三种带有高表达于HCC的HLA-A2限制的CTL表位的HBc-VLPs、三种抗原表位肽和不含HCC表位野生HBc-VLPs分别负载HLA-A2转基因小鼠BMDCs制备成DC疫苗,阴性对照组用PBS替代。将HLA-A2转基因小鼠分为四组,分别免疫上述DC疫苗并对其免疫效果进行评价:体外检测抗原特异性淋巴细胞内IFN-γ的产生和CTL细胞活性并观察不同方法处理的DCs对肿瘤生长的抑制情况。结果:与其他组相比,HBc-VLPs负载的DCs免疫小鼠后第8天,流式细胞仪即可检测到分泌IFN-γ的CD8+T细胞存在;用LDH法检测到较强的抗原特异性CTL活性;在肿瘤接种后的20天之前均未见到明显的肿瘤块,具有显著抗肿瘤作用。结论:利用携带HCC抗原表位的HBc-VLPs负载DCs后得到可强烈诱导免疫活性和明显抗肿瘤作用的DC疫苗,为DC疫苗的优化和评价提供了实验方法,也为进一步深入研究新型肝细胞癌治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础。

正负电荷改性乙肝病毒样颗粒的构建及性能评价

乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)可在体外自组装成二十面体的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),但是其较低的自组装效率及稳定性制约其应用.通过蛋白质改造修饰,在野生型HBc(wtHBc)的免疫显性区(major immunodominant region,MIR)分别插入带电多肽序列RRRRRRRR和DDDDDDDD,以通过荷电基团及静电相互作用的引入提高VLPs稳定性.经大肠杆菌重组表达,成功获得携带额外电荷的HBc突变体(mHBc),包括携带额外正电荷的m+HBc和负电荷的m-HBc.结果表明,mHBc的二级结构富含α-螺旋,与wtHBc一致.m+HBc和m-HBc等比例混合可在体外实现自组装,所得mHBc VLPs粒径为(30.44±2.23)nm,与野生型一致.该自组装过程及组装体稳定性受离子强度和pH值影响.使用尺寸排阻色谱、原子力显微镜、动态光散射等方法表征和分析VLPs在不同缓冲液中的稳定性差异.发现wtHBc VLPs可稳定存在于0.3~0.7 mol/L NaCl溶液中,盐浓度过高或过低均会使其稳定性降低.pH响应性实验表明,wtHBc VLPs的最佳组装及稳定pH值为7.4,偏离此pH值使其稳定性降低.在低于pH=5.5的环境下,其相对稳定性明显降低,只达到pH=7.4的64.2%.而mHBc VLPs的稳定性差异随pH值变化不大,在pH测试范围5.5~9.5的相对稳定性均高于88.3%.以上研究结果表明,正、负电荷基团的引入可提高HBc VLPs对pH值变化的耐受性,拓宽稳定pH值区间,增强VLPs的稳定性,利于其实际应用.

促吞噬肽功能化的HBc VLPs纳米载体的制备

促吞噬肽(Tuftsin)是机体脾组织产生的生理活性肽,具有强大的免疫调节和免疫治疗潜力。乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒(hepatitis B virus core protein virus-like particles, HBc VLPs)是由HBc自组装形成的空心纳米颗粒,其不仅能应用于药物的递送,还能应用于外源蛋白质的显示。因此,Tuftsin功能化HBc VLPs载体的研究在免疫治疗、分子递送等方面具有重要意义。本研究选用PET43.1-a质粒作为Tuftsin-HBc VLP的表达载体,以大肠杆菌BL21 (DE3)为工程菌进行诱导表达,通过盐析、分子筛层析和离子交换层析技术纯化生产Tuftsin-HBc VLP。利用Western印迹和ELISA分别对Tuftsin-HBc VLP上HBc和Tuftsin进行定性分析。结果显示,Tuftsin-HBc VLP可与抗HBc抗体和抗Tuftsin抗体发生特异性结合。透射电镜观察结果显示,Tuftsin-HBc VLP呈大小均一的球形结构,粒度分析仪测得Tuftsin-HBc VLP的直径约为30 nm。CCK8法显示,Tuftsin-HBc VLP在0~480μg/mL范围内,细胞增殖未见显著变化。上述结果表明,本研究成功制备了可以在原核系统中高效表达且安全有效的Tuftsin-HBc VLP生物纳米递送载体。

乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒作为载体在表位疫苗中的应用

乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)C基因编码的病毒蛋白,是HBV的衣壳蛋白,主要存在于HBV核衣壳表面。乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)来源于HBcAg,由183或185个氨基酸组成。由于HBc本身具有高度的免疫原性,并且可携带自身或外源病原体的抗原/表位在体外自组装成病毒样颗粒,20世纪80年代开始HBc就被用于疫苗载体的研究。现对HBc近年来作为载体在表位疫苗中的应用作一概述。

乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒作为疫苗载体的研究进展

乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)可自发形成二十面体的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)结构,VLPs结构有利于诱发特异性的体液和细胞免疫反应。将外源性抗原表位插入至HBc的N-末端、C-末端或其内部免疫显性区,可诱导机体产生针对外源性抗原的特异性免疫应答。本文对HBc作为疫苗载体的结构基础、设计方法、佐剂效应及其应用等内容作一综述。

以乙型肝炎病毒核心蛋白颗粒为载体的流感通用疫苗的构建

目的构建以乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus coreprotein,HBc)颗粒为载体的含流感病毒M2基质蛋白胞外功能区(M2 ectodomain,M2e)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)保守表位的流感通用疫苗,评价其抗不同亚型流感病毒感染的保护作用。方法采用基因工程方法将流感病毒M2e的3拷贝重复片段与NP的CTL表位串联,插入HBc刺突顶端的免疫优势决定区,构建重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG16℃低温诱导表达。表达的融合蛋白HBc-3M2e-NP经纯化后,电镜观察病毒样颗粒形成情况。纯化的融合蛋白分别经鼻腔和腹腔免疫小鼠,对照组注射等体积的PBS,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾组织中CD4+、CD8+T淋巴细胞水平;以流感病毒攻毒,检测融合蛋白的保护效果。结果重组表达质粒pET-21a-HBc-3M2e-NP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,以包涵体和可溶性两种形式表达,且可与鼠抗M2e单抗发生特异性反应。纯化的融合蛋白纯度大于90%,且能够自动装配成病毒样颗粒。用该病毒样颗粒免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对不同流感病毒毒株的特异性抗体;2种途径免疫的小鼠脾组织中CD4+T淋巴细胞含量和CD4+/CD8+T淋巴细胞比例均较对照组明显升高;攻毒试验结果显示,具有交叉保护作用。结论构建的流感通用疫苗能够诱导机体产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答及有效的交叉保护作用,为流感通用疫苗的深入研究奠定了基础。

含RGD修饰的病毒样颗粒递送ICG靶向肿瘤的研究

目的:获取含RGD靶向肽的乙肝核心病毒样颗粒,为药物靶向纳米递送系统提供一种新型载体。方法:将实验室前期构建测序正确的含RGD修饰的乙肝核心病毒重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,单因素分析及正交试验探究重组蛋白最适表达条件。在最适表达条件下扩培,收集菌体超声破碎后离心,采用凝胶过滤层析、离子交换和蔗糖密度梯度离心进行纯化,利用透射电镜对形成的RGD-HBc VLPs的形态及稳定性进行鉴定。纯化的RGD-HBc VLPs利用其体外自组装的特性,将光敏剂ICG装载到颗粒的内部,通过静脉注射到4T1乳腺癌荷瘤小鼠,探究重组RGD-HBc VLPs作为纳米递送系统的靶向性。结果:RGD-HBc VLPs在温度32℃、IPTG0.5mmol/L、诱导4h时以可溶性蛋白的形式得到高效表达。经蔗糖密度梯度离心纯化后纯度到达95%以上。透射电镜下观察纯化的RGD-HBc VLPs形态、大小均一,直径约为32nm,通过近红外荧光活体成像证实了RGD-HBc作为纳米载体的靶向性。结论:经表达和纯化后,RGD-HBc VLPs具有较高的表达量和大小均一的形态外貌,近红外荧光活体成像证实具有较好的靶向性,这不仅为肿瘤的可视化诊断提供一种快速、精准、方便的方法,而且为今后靶向免疫治疗提供一种新型载体。

层析介质Capto Core400和Sephacryl S-1000纯化乙型肝炎病毒核心蛋白病毒样颗粒效果的比较

目的比较层析介质Capto Core400和Sephacryl S-1000纯化乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的效果。方法采用两种层析介质纯化相同3批HBc VLPs蛋白粗提液,BCA法检测纯化样品的蛋白浓度,计算蛋白回收率;体积排阻色谱法检测纯度;马尔文粒径仪检测HBc VLPs粒径;透射电子显微镜观察HBc VLPs形态。结果层析介质Sephacryl S-1000和Capto Core400纯化HBc VLPs的蛋白回收率分别为75.5%和70.5%,蛋白纯度分别为87%和99%,粒径大小均为(30±4)nm,均一性良好;与Sephacryl S-1000比较,经Capto Core400纯化的HBc VLPs分布更均匀。结论Capto Core400纯化HBc VLPs的纯度及颗粒分布均匀性更佳,且该层析介质装量小,纯化时间短,更适用于HBc VLPs的规模化生产。