人regucalcin和红色荧光蛋白融合基因的构建及表达

目的:构建人regucalcin(RGN)全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,观察RGN及红色荧光蛋白(DsRed)在人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达。方法:RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA,将扩增的产物进行T-A克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将RGN基因酶切后构成pDsRed-RGN,再将RGN基因与DsRed一起酶切构建成pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入HK-2细胞,激光共聚焦显微镜观察重组质粒的表达情况。结果:RT-PCR扩增获得人HK-2细胞,其RGNcDNA全长897bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo,经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。经zeocin(zeo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株。激光共聚焦显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有红色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了pcDNA3.1-RGN-DsRed-zeo真核表达质粒,并发现其在HK-2细胞中表达。

一种乙肝表面抗原结合蛋白可作为疫苗佐剂

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白,该蛋白已经被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用.目前,我们已经利用毕赤酵母表达系统获得了能够分泌表达SBP的毕赤酵母表达菌株.本研究通过对上述菌株的发酵产物进行超滤和亲和层析纯化,获得了一定量的高纯度重组SBP蛋白,并利用酶联免疫吸附检测(ELISA)法和表面等离子体共振(SPF)法分别对重组SBP进行了体内外生物学活性的初步检测,证实其具有与HBsAg结合的能力,并求得了二者之间的亲和常数.将重组SBP作为乙肝疫苗增效剂与乙肝疫苗共同免疫小鼠,SBP增效组小鼠与对照组相比,血清中HBsAg抗体显著升高,表明SBP在体液免疫方面对乙肝疫苗具有显著的增效作用.上述结果表明,SBP有望作为乙肝疫苗的免疫佐剂,在乙型肝炎防治方面有重要意义.

一种新的乙型肝炎病毒表面抗原结合蛋白的筛选、表达及其生物学活性的初步研究

为了研究乙肝病毒侵染肝细胞过程中的功能蛋白 ,通过印迹免疫分析技术从人肝cDNA噬菌体表达库中筛选出一株编码乙肝表面抗原结合蛋白 (hepatitisBsurfaceantigenbindingprotein ,HBsAg BP)的cDNA克隆 .基因测序结果表明 ,该cDNA具有独立的开放阅读框架 ,编码 1个由 344个氨基酸残基构成的可溶性蛋白分子 ,属于免疫球蛋白超家族成员 .将该基因克隆到原核表达载体pTriplEx后 ,在E .coliXL1 Blue菌株中获得 4 4kD的重组蛋白 .重组蛋白经Western印迹和ELISA实验证明具有与乙肝表面抗原特异性结合的能力 .进一步经流式细胞仪实验显示 ,在纯化的重组蛋白存在的情况下 ,天然的HBsAg与肝细胞株HepG2的亲和力显著增高 .结果显示 ,该乙肝表面抗原结合蛋白可能是介导乙肝病毒对肝细胞亲和侵染的可溶性辅助受体 .

乙肝表面抗原结合蛋白的红色荧光示踪分子的表达纯化和功能鉴定

乙肝表面抗原结合蛋白（HBsAg binding protein，SBP）是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白，已被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。DsRed—Monomer是来源于DsRed的人工突变体，作为蛋白表达的报告基因在真核细胞中使用。为探究SBP的作用机理，通过基因工程方法将该基因与DsRed—Monomer基因连接，克隆到原核表达载体，表达带有红色荧光的融合蛋白，该蛋白通过荧光激发检测显示荧光强度与蛋白量成正比例关系。同时该融合蛋白经过ELlSA方法检测可以与HBsAg特异性结合，使用常规方法和荧光量检测两种方法测定得到的该蛋白与HBsAg的亲和常数相似。首次证实了DsRed—Monomer在原核表达中可作为报告基因进行研究和使用，建立了利用荧光量检测蛋白的方法，与常规ELISA方法比较证明，大大缩短了试验时间和步骤，可以更方便的应用于分子示踪及其功能研究。

乙肝表面抗原结合蛋白SBP在毕赤酵母中的表达纯化及功能鉴定

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是本实验室发现的一种人源蛋白,该蛋白与人乙型肝炎病毒HBV表面抗原HBsAg存在特异性的结合能力。此前的研究证实SBP具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。为进一步研究该蛋白的生理功能和作用机制,利用毕赤酵母表达系统进行了SBP的表达菌株构建,筛选得到了SBP的高效表达菌株。发酵产物经过分离纯化,最终得到了大量高纯度的真核来源的目的蛋白。通过SDS-PAGE、高效液相色谱、Western blotting和质谱鉴定,证实所得到的蛋白具有较高的纯度和完整性。通过ELISA方法初步证实了其与乙肝表面抗原具有较好的结合能力。该研究为进一步进行SBP的体内外功能研究及免疫增效研究打下了基础。