胶体金免疫层析试纸条在生物毒素检测领域的研究进展

胶体金免疫层析试纸条是一种常用的检测方法,广泛应用于疾病诊断、生物毒素检测等领域。该技术基于胶体金标记的特异性抗原(抗体)与待检样品中的目标分子相互作用,在试纸条上形成可见的测试线或信号变化。其流程包括样品预处理、标记抗体制备、试纸条组装步骤。胶体金免疫层析试纸条可以用于快速检测食品中的毒素残留、环境中的有害物质以及临床诊断中的相关指标。该技术具有无创、快速、灵敏和准确的特点,在临床应急检测和大规模筛查中能快速获得结果。文章总结了胶体金免疫层析试纸条技术及其在生物毒素检测中的研究进展,并分析了当前胶体金免疫层析试纸条技术的优缺点,展望了该技术在生物毒素检测领域的未来发展方向。

检测牙龈卟啉单胞菌胶体金试纸条的制备与应用

目的制备简单、快速检测唾液P.gingivalis的胶体金试纸条。方法采用识别P.gingivalis不同表位的单抗E10、G3建立双抗夹心ELISA体系,鉴定双抗夹心ELISA识别P.gingivalis的特异性及敏感性。利用单抗E10、G3制备胶体金试纸条,检测胶体金试纸条识别P.gingivalis的特异性。应用胶体金试纸条与实时定量PCR检测受试者唾液P.gingivalis并比较二者检测P.gingivalis的差异。结果单抗E10、G3建立双抗夹心ELISA体系可特异性识别P.gingivalis,识别敏感性≥5×10^(7)CFU/mL。单抗E10和G3制备的胶体金试纸条特异性识别P.gingivalis。胶体金试纸条与实时定量PCR分别检测受试者唾液P.gingivalis,试纸条与PCR检测对牙周炎的检出效果无统计学差异,检测P.gingivalis的细菌数量无统计学差异。胶体金试纸条检测唾液P.gingivalis,牙周炎组、牙周健康组阳性率分别为40%、10%。结论制备出检测P.gingivalis的胶体金试纸条,可特异性检测P.gingivalis,具有检测唾液中P.gingivalis的潜力。

牛传染性鼻气管炎病毒胶体金检测试纸条的研制和评价

为建立快速检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的病原学检测方法,本试验采用杂交瘤细胞融合技术制备IBRV单克隆抗体,以其作为检测原,优化反应条件并组装IBRV胶体金检测试纸条,验证该试纸条的特异性、灵敏性、敏感性和稳定性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较分析。结果显示,共制备7株针对IBRV的单克隆抗体,其中以胶体金标记的单克隆抗体2B7作为捕获抗体、1B9作为检测抗体,建立的胶体金检测试纸条能够检测样品中的IBRV;该试纸条与病毒性腹泻/黏膜病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌无交叉反应,检测限为4.04×10~4TCID50/0.1 mL,敏感性为86.7%;在室温条件下保存12个月仍能够有效检测IBRV,说明该试纸条稳定性良好。与qPCR比较结果显示,2种方法检测结果的符合率为92.85%,说明该胶体金检测试纸条能够用于IBRV的临床诊断。结果表明,本试验利用IBRV的单克隆抗体建立的胶体金检测试纸条灵敏度高且特异性好,为IBRV抗原检测和流行病学调查提供技术支持。

碳青霉烯类和喹诺酮类双重耐药核酸胶体金试纸条快速检测方法的建立及试剂盒研制

目的:建立双重核酸胶体金试纸条快速检测鲍曼不动杆菌(Ab)OXA和par C耐药基因的方法并研制试剂盒。方法:采用加热煮沸法提取Ab的DNA,根据NCBI选择Ab的OXA和par C基因序列作为靶基因片段,设计引物并分别用6-FAM、地高辛和生物素进行标记,研发耐药基因检测试剂,采用双重核酸胶体金试纸条实现快速、可视化检测。采用分子克隆、测序技术克隆阳性对照品评价试剂盒的特异性、灵敏度和稳定性。结果:水煮法提取的Ab DNA浓度和纯度较好。克隆测序后的质粒DNA与GenBank数据库中基因序列的同源性均为100%;试剂盒的特异性良好,仅Ab出现阳性,其他菌属等均为阴性;双重核酸胶体金试纸条中Ab的DNA浓度降到10-3ng/μl时仍出现红色线,与电泳的最低检测限10-2ng/μl相比,灵敏度高出10倍;试剂盒分别在第3、6和9个月进行检测,稳定性较好。结论:本研究建立的Ab双重耐药检测试剂盒可同时检测Ab的OXA和par C耐药基因,具有高灵敏度、强特异性、快速简便等优点,为临床Ab碳青霉烯类和喹诺酮类抗生素耐药检测提供了一种新型快速的检测方法。

恙虫病东方体混合重组抗原应用于胶体金免疫层析试纸条的制备及效价检测

胶体金免疫层析试纸条具有携带方便、操作简单且敏感性、特异性高等特点,近年来开始广泛应用于疾病的诊断。为了实现对恙虫病的快速检测,笔者利用双抗原夹心法,以胶体金标记恙虫病东方体56 kDa混合重组蛋白,56 kDa混合重组蛋白和兔抗恙虫病东方体多克隆抗体分别喷在检测线及质控线上,制备了用于检测恙虫病东方体抗体的胶体金免疫层析试纸条。本研究制备的胶体金试纸条检测限为61 ng/mL,和疟疾、伤寒、血吸虫、出血热以及斑点热等阳性血清无交叉反应,特异性达90%(54/60),检测的敏感性为91.96%(103/112),在4℃下可稳定保存6个月。本试纸条能够应用于人体血清中恙虫病东方体总抗体的检测。

猪轮状病毒胶体金检测试纸条的研制及应用

【目的】利用2株猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)单克隆抗体,研制胶体金检测试纸条,用于PoRV的临床快速检测。【方法】制备40 nm粒径的胶体金溶液标记单克隆抗体4G5,将单克隆抗体5G4和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测线和质控线。通过优化胶体金溶液最适pH、标记抗体和检测抗体的最佳使用量,制备PoRV胶体金检测试纸条;对试纸条的灵敏度、敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评价。通过检测50份猪粪便样品,计算试纸条与RT-PCR方法的符合率,最后采用试纸条进行1249份临床样品的测定。【结果】经优化后试纸条的最佳参数如下:胶体金溶液最佳pH为8.0,标记抗体4G5和检测抗体5G4最佳使用量分别为14.4μg/mL和1 mg/mL。试纸条能检测出1∶2000稀释的PoRV OSU株(G5型)病毒液,灵敏度为104.5TCID50/mL,且检测PoRV G9、G3和G4型毒株均为阳性。检测猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)均为阴性。批内和批间重复性、稳定性良好。检测50份猪粪便样品,与RT-PCR方法的阳性符合率为97.5%(39/40),阴性符合率为100%(10/10),总体符合率为98%(49/50)。检测2022年在河南、山西省猪场收集的临床样品1249份,阳性检出率为5.2%。【结论】本研究制备的PoRV胶体金检测试纸条具有良好的敏感性、特异性和重复性等优点,与RT-PCR方法的符合率较高,可用于规模化猪场PoRV的快速检测。

黄曲霉毒素B_(1)胶体金免疫层析试纸条的制备及性能研究

以黄曲霉毒素B_(1)为研究对象,制作出一种可实现对黄曲霉毒素B_(1)含量快速检测的胶体金试纸条。实验采用竞争抑制法,基于试纸条的层析作用,以胶体金为标记物与黄曲霉毒素B_(1)单抗偶联,将黄曲霉毒素B_(1)抗原和羊抗鼠二抗固定到硝酸纤维膜上作为检测线和质控线,制备出可以快速检测黄曲霉毒素B_(1)的免疫层析试纸条。通过优化,试纸条在37℃条件下,分别在5,10,15,20 d后测试,效果没有明显降低,检测灵敏度为20 ng/mL;与磺胺类药物、“瘦肉精”类药物均无交叉反应。该试纸条具有良好的稳定性和特异性,可实现生物样本中黄曲霉毒素B_(1)的快速大量检测。

检测鸡血清多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条的研制与应用

为建立快速检测鸡血清多杀性巴氏杆菌(Pm)抗体的胶体金免疫层析技术,本研究采用胶体金标记兔抗鸡IgG,制备金标垫,将重组脂蛋白B(rPlpB)和羊抗兔IgG抗体分别包被于硝酸纤维膜作为检测线和质控线,优化条件后组装成胶体金试纸条(CGTS)。结果显示,胶体金标记兔抗鸡IgG的最佳pH为8.5,最佳标记浓度为7μg/mL;rPlpB和羊抗兔IgG抗体的最佳使用浓度均为0.2 mg/mL。利用该方法检测SPF鸡血清,鸡Pm、鸡大肠杆菌、鸡沙门菌、鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒阳性血清,结果显示仅鸡Pm阳性血清检测为阳性,其他均为阴性,表明CGTS的特异性强。将琼脂扩散(AGP)效价为1∶16的鸡Pm阳性血清2倍倍比稀释后以CGTS检测,结果显示1∶320倍稀释仍检测为阳性,表明CGTS的敏感性较高。检测鸡Pm阳性血清和SPF鸡血清时,同批次不同试纸条之间、不同批次之间均无差异,表明该方法的重复性好。对89份鸡血清采用CGTS和间接ELISA检测,结果显示,二者阳性符合率为91.5%,阴性符合率为100%,总符合率为94.4%。禽霍乱灭活疫苗免疫后14 d,66.7%的鸡采用该方法能够检出抗体阳性,免疫后21 d,所有鸡均检出抗体阳性。本研究首次基于rPlpB建立了检测鸡血清Pm抗体的CGTS方法,该方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好,适合在基层推广,为评价禽霍乱疫苗的免疫效果提供了可行技术。

鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用

为建立快速检测鸭血清多杀性巴氏杆菌抗体的方法,将兔抗鸭IgG标记胶体金,喷涂金标垫,用浓度为0.2 mg/mL的荚膜和0.2 mg/mL羊抗兔IgG抗体分别作为检测线和质控线,制备了检测鸭多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条(D-CGTS)。特异性试验显示,仅鸭抗多杀性巴氏杆菌血清检测为阳性,阴性血清、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清的检测结果均为阴性,表明D-CGTS的特异性良好。敏感性试验结果显示,对效价1∶16(琼脂扩散试验)的鸭抗多杀性巴氏杆菌血清1∶320倍稀释后采用制备的试纸条检测结果仍为阳性,表明D-CGTS的敏感性较高。重复性试验结果显示,同批次的不同试纸条和不同批次的试纸条,检测阴性血清和鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的结果相同,表明D-CGTS的重复性好。对92份鸭血清采用D-CGTS和ELISA进行检测,结果显示,阳性符合率为94.03%,阴性符合率为100%,总符合率为95.65%。结果表明,制备的D-CGTS操作简单,具有较强的特异性、较高的敏感性和较好的重复性,适合在兽医临床推广应用。

牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制

为建立一种快速准确且便携的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,本研究将制备的BVDV单克隆抗体(MAb)作为检测线(T线),以纯化的免源多克隆抗体作为金标蛋白,以羊抗兔IgG-HRP作为质控线(C线),组装成双抗体夹心胶体金层析试纸条,并优化各反应条件。结果显示,最适金标蛋白标记量为30μg/mL,BVDV MAb和羊抗兔IgG-HRP最佳浓度均为0.5 mg/mL。利用猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)及BVDV临床分离株评估该试纸条的特异性,结果显示,除阳性对照和BVDV临床分离株检测为阳性外,其余病毒均为阴性,表明该试纸条的特异性较强,无交叉反应。将BVDV-NADL株(10^(6.6)ELD_(50)/mL)10倍倍比稀释后,利用该试纸条检测,结果显示其最低检出量为10^(4.6)ELD_(50)/mL。利用同一批次和不同批次制备的试纸条对CSFV、IBRV、BPSV、BVDV临床分离株检测,结果显示检测结果均一致,表明该试纸条的重复性良好。将制备的试纸条应用于检测临床采集的68份牛血清样品,并以RT-PCR方法同时检测,结果显示胶体金试纸条对BVDV的阳性检出率为17.5%(12/68),RT-PCR对BVDV的阳性检出率为26.5%(18/68),两者之间的总符合率为88.24%。本研究于国内首次采用双抗体夹心方式制备了检测BVDV的胶体金免疫层析试纸条,该方法方便快捷,特异性及敏感性均较好,适宜于牛场BVDV的快速筛选,为进一步研制BVDV胶体金检测试剂盒提供了实验依据。

牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制

研究旨在制备一种现场快速筛查牛赤羽病的免疫层析试纸条。通过胶体金标记赤羽病病毒N蛋白,将兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多克隆抗体分别喷涂于NC膜上作为检测线(T)和质控线(C)。结果显示,牛赤羽病毒阳性抗体血清稀释度为1∶512时,检测线仍显色;且与牛病毒性腹泻病毒、牛结核病、布鲁氏菌病、牛巴氏杆菌病、地方流行性牛白血病毒和蓝舌病毒的阳性血清均无交叉反应;使用试纸条和商品化ELISA试剂盒同时检测40份田间牛血清样品的结果符合率为92.6%。研究表明,试纸条适用于基层养殖户对牛赤羽病的筛查。

鸭坦布苏病毒E蛋白Domain Ⅲ单克隆抗体胶体金试纸条的创制及应用

为建立一种快速诊断鸭坦布苏病毒(DTMUV)的方法,以2株(B9D7B8G10和B9D10C7株)抗DTMUV的单克隆抗体制备DTMUV胶体金免疫层析试纸条。采用经典的柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液,利用rProtein G琼脂糖凝胶亲和层析法对两株单克隆抗体腹水进行纯化并鉴定;以纯化的B9D7B8G10株单克隆抗体作为标记抗体,通过调节单克隆抗体浓度与pH确定胶体金探针最佳结合条件;同时,在硝酸纤维素膜(NC膜)检测带包被纯化的B9D10C7株单克隆抗体,质控带包被山羊抗小鼠IgG抗体,建立检测DTMUV胶体金免疫层析试纸条;成功建立试纸条后,对试纸条敏感性、特异性、重复性和稳定性进行检测,并与RT-PCR检测方法进行比较,对200份临床疑似感染样品进行检测。结果显示:制备的胶体金试纸条在15 min内即可完成检测,最低检测稀释度为1:50,且不与鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅星状病毒、禽白血病病毒发生交叉反应;应用试纸条和RT-PCR方法分别对200份临床疑似样品进行检测,两者符合率达98%。结果表明,制备的胶体金试纸条敏感性高、特异性强、稳定性好、重复性好,为DTMUV的快速检测提供了一种实用检测技术。

呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条快速检测方法的建立和评价

目的:采用聚合酶链式反应(PCR)技术和胶体金技术建立一种呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条检测方法,并对其检测效果进行评价。方法:根据GenBank数据库选择真菌内转录间隔区(ITS)基因片段作为靶基因,应用DNAMAN软件对真菌ITS基因片段进行分析,并分别在真菌通用引物5'端用生物素(Biotin)和异硫氰酸荧光素(FITC)进行修饰标记;建立PCR体系,进行体系的最佳条件优化;确定胶体金免疫层析试纸条标记链霉亲和素的最佳标记量和质控线及检测线最佳包被物浓度,组装核酸胶体金试纸条,对试纸条的特异度、灵敏度、重复性和稳定性进行验证。结果:水煮法提取白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌DNA,浓度为180μg·L^(-1)以上,纯度为1.60~2.10;在pH 7.0条件下,每100μL胶体金溶液中制备胶体金标记链霉亲和素最佳标记量为3.3μg,质控线包被Biotin化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)浓度为2.00 g·L^(-1),检测线包被抗FITC抗体浓度为1.00 g·L^(-1)。核酸试纸条的特异度与电泳结果一致,仅白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌出现阳性结果,与金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等常见呼吸道感染细菌无交叉反应。灵敏度检测,白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌的DNA浓度分别为10-4、10-2和10-3 mg·L^(-1)时核酸试纸条仍可准确检出,而普通PCR电泳结果显示白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌最低检测浓度分别为0.01、1.00和0.10 mg·L^(-1);重复性检测,在不同实验室不同操作人员对核酸试纸条进行验证,结果一致,重复性良好;稳定性检测,核酸试纸条在第6、9和12个月进行检测,结果符合预期,稳定性良好。结论:本研究建立的呼吸道真菌感染核酸胶体金试纸条可以检测白假丝酵母菌、新生隐球菌和毛霉菌等真菌,特异度和灵敏度均较高,操作简便且快速。

应用于RPA nfo反应产物结果可视化的胶体金试纸条制备与评价

旨在利用6-羧基荧光素(6-FAM)与6-FAM单克隆抗体、生物素与链霉亲和素之间的特异性结合,制备可用于nfo酶切割探针的重组酶聚合酶(RPA)反应产物结果可视化的胶体金侧向免疫层析试纸条(GICS)。通过杂交瘤法和诱生腹水法制备了高亲和力的6-FAM单克隆抗体(亲和力常数为5.38×10~9 L/mol),再运用高浓度NaCl破坏试验,确定了胶体金与6-FAM抗体的最佳标记pH值为8.0,最佳抗体标记量为12μg/mL,并使用模拟样本确定了最佳检测(T)线包被缓冲液为0.2 mol/L(pH值5.0)。然后使用RPA nfo反应产物作为实际样本,观察条带的深浅,最终确定在层析液为0.1 mol/L PB(pH值7.4)、T线包被1 mg/mL SA、反应液用量5μL及金标抗体用量10μL条件下,能实现试纸条最佳检测性能。自主研发的胶体金侧向免疫层析试纸条在加样5 min后能出现清晰的条带,与目前商品化试纸条的可视化判定结果一致,能替代现有的商品化试纸条,降低检测成本、缩短检测时间,对建立RPA nfo-GICS及RPA-CRISPR Cas12a-GICS检测方法奠定了基础。

大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

本文采用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金溶液标记大肠杆菌O157:H7抗体(6C1E5),然后将其包被于金标垫上,再将大肠杆菌O157:H7抗体(10G1A2)和兔抗鼠IgG分别包被于硝酸纤维素膜作为检测线和质控线,研制出的大肠杆菌O157:H7胶体金免疫层析快速检测试纸检测灵敏度达104 CFU/mL,并与鼠寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌等8种菌株无交叉反应,显示出较强的特异性。

免疫快速同步检测玉米中5种真菌毒素胶体金试纸条的构建和应用

玉米作为重要的粮食和饲料来源,容易受到多种真菌毒素的污染,给居民健康和养殖业造成严重的危害。本文优化了适合5种真菌毒素(黄曲霉毒素B1、伏马毒素、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮)同时提取的样品前处理方法,并构建了5检测线胶体金试纸条,检测结果可以通过肉眼定性,结合Image J软件可以进行定量分析,并应用于实际玉米样品检测。结果表明,最佳提取条件为90%乙腈/水,涡旋20 min,样品的添加回收率为71.9%~113.3%,相对标准偏差为0.9%~7.5%;测定基质添加样品建立标准曲线,通过肉眼判定得到5种真菌毒素的消线值分别为80.0、1 000.0、100.0、400.0、200.0μg/kg;结合Image J软件提取多重检测试纸条的检测线灰度值,结果表明当AFB1、FB1、T-2、DON和ZEN的质量分数为8.0、20.0、10.0、40.0、20.0μg/kg时,各真菌毒素浓度对应的检测线显色值比空白对照显色值低。最后,通过检测11个实际玉米样品,结果表明部分玉米样品受到了不同程度的AFB1、DON和ZEN的污染。因此,本研究开发的免疫快速同步检测玉米中5种真菌毒素胶体金试纸条可以用于玉米中真菌毒素的现场快速筛查。

ELISA法与胶体金试纸条检测HBsAg差异分析

目的探究胶体金试纸条与ELISA法检测HBsAg临床应用价值。方法分别用胶体金试纸条与ELISA法检测360份标本中的HBsAg,并对阳性率进行比较,然后将强阳性的10份标本作倍比稀释,观察2种检测方法灵敏度的差异。结果2种方法的阳性率之间无显著差异,ELISA法灵敏度较胶体金试纸条灵敏度高。结论2种方法皆是检测HBsAg的良好方法,胶体金试纸条法操作简便、快速适用于急诊及健康人群的筛查,ELISA法适用于常规检测。

安眠酮胶体金免疫快速检测试纸条的研制

为快速检测出猪肉等动物源性食品中安眠酮的残留,利用胶体金免疫层析技术制备安眠酮快速检测试纸条。通过化学方法合成安眠酮半抗原和安眠酮抗原,利用免疫反应制备安眠酮多克隆抗体,以安眠酮多克隆抗体和安眠酮包被抗原作为主要原料,制备安眠酮胶体金免疫快速检测试纸条。结果表明,研制的试纸条对动物组织样本的检测限为20μg/kg,对尿样的检测限为30μg/kg,检测时间不超过5 min,与500μg/kg的四环素类、喹诺酮类、磺胺类等药物均无交叉反应,特异性较好,假阳性率≤5%,假阴性率≤0.5%。该方法操作简便、快速、灵敏、准确、稳定,适用于动物源性食品中安眠酮残留的现场快速检测和筛查。

肉制品中卡那霉素胶体金快速检测试纸条的研制

为实现对肉制品中卡那霉素残留的快速检测,研制了一种卡那霉素胶体金检测试纸条.根据实验结果确定了胶体金试纸条的最佳制备条件,然后对研制的试纸条的灵敏度、特异性和稳定性进行测试.结果表明,该试纸条的最低检测限为100μg/L,试纸条对卡那霉素具有明显的特异性,稳定性好.该试纸条能够用于肉制品中卡那霉素残留的快速检测,而且经济、简便,具有实用价值.

ELISA法与胶体金试纸条检测HBsAg差异分析

目的:探究胶体金试纸条与ELISA法检测HBsAg的临床应用价值。方法:用ELISA法检测4183份标本中的乙肝标志物,对检出的406份HBsAg阳性标本再用胶体金试纸条法进行检测比较,并将强阳性的20份标本做倍比稀释,观察两种检测方法的吻合程度。结果:两种方法无显著性差异,ELISA法灵敏度稍高于胶体金试纸条。结论:两种方法皆是检测HBsAg的良好方法,胶体金试纸条法操作简便、快速,适用于急诊及健康人群的筛查,ELISA法适用于常规检测。