HBx基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2周期的影响

目的探讨HBx基因通过调节miR-192的表达影响人肝癌细胞株HepG2周期进展的机制。方法流式细胞仪分析以下3组细胞的周期变化:HepG2/HBx细胞(HepG2细胞稳定转染HBx基因)、HepG2/pcDNA3.1细胞(HepG2细胞稳定转染空载体pcDNA3.1)以及HepG2细胞。3组细胞中miR-192的表达采用Taqman探针荧光定量PCR法检测。流式细胞术观察转染miR-192后HepG2细胞的周期分布变化,SYBR Green荧光定量PCR和Westernblot分别检测miR-192对HepG2细胞p53、CDKN1A mRNA和蛋白表达的影响。结果 3组细胞中,HepG2/HBx细胞G0/G1期细胞比例明显降低[(52.78±4.08)%vs(67.37±4.87)%,(65.08±5.15)%],S期和G2/M期比例明显升高[S期:(25.22±1.84)%vs(19.78±1.26)%,(18.84±1.68)%;G2/M期:(22.00±2.07)%vs(12.85±1.29)%,(16.08±1.44)%]。HepG2/HBx细胞miR-192表达显著下调[(49.1±5.9)%vs(98.0±8.9)%,(100.0±9.1)%]。转染miR-192引起HepG2细胞G0/G1期和G2/M期阻滞,同时p53、CDKN1A mRNA(p53:1.68±0.12 vs 0.90±0.06;CD-KN1A:2.36±0.12 vs 1.05±0.06)和蛋白(p53:3.07倍;CDKN1A:2.82倍)的表达水平亦显著上升。结论 miR-192通过促进p53和CDKN1A表达引起HepG2细胞周期阻滞,而HBx通过下调miR-192加速HepG2细胞周期进程。

肝细胞癌组织中HBx基因缺失型突变体真核表达载体的构建和鉴定

目的构建缺失型突变体HBx-d382和HBx-d431真核表达载体。方法以pGM-T/HBx-d382和pGM-T/HBx-d431质粒为模板,PCR扩增含KpnⅠ和ApaⅠ酶切位点的HBx基因片段。双酶切后再与载体pcDNA3载体重组连接。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后,经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体。结果成功构建了重组pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体,经DNA序列测定与比对,重组前后HBx基因片段序列一致。结论pcDNA3/HBx-d382和pcDNA3/HBx-d431真核表达载体构建成功,可为HBx基因缺失型突变体,特别是HBx-d382基因的生物学功能研究提供基因材料。

HBx基因下调p21对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建转基因细胞模型HepG2/HBx,观察HBx基因对HepG2细胞增殖、周期和凋亡的影响,探讨细胞周期蛋白P21在其中的作用和意义.方法:应用脂质体转染和G418筛选构建稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx,RT-PCR和Western blot鉴定HBxmRNA与蛋白的表达.分别以四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术检测HepG2/HBx细胞及对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞(转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞)的增殖、周期和凋亡.另半定量RT-PCR检测各组细胞中细胞周期蛋白P21与抑癌基因p53 mRNA的表达.结果:HepG2/HBx细胞中有HBx mRNA和蛋白的表达.HepG2/HBx细胞生长速度加快.HepG2/HBx中G0/G1期细胞比例较对照组显著减少(43.34%±3.11%vs57.69±4.28%,P<0.01),S期细胞比例明显增加(28.69%±1.17%vs22.41%±1.99%,P<0.05),同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低(1.19%±0.06%vs5.43%±0.42%,P<0.001).细胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx细胞中的表达较对照组细胞显著降低(0.16±0.05vs0.78±0.15,P<0.001),而p53表达则无显著变化.结论:HBx基因可下调细胞周期蛋白P21mRNA的表达,可能参与HBx基因加速HepG2细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的作用.

RNA干扰HBx基因对肝癌细胞化疗效果的影响

目的:探讨RNA干扰技术和传统的化疗方法联合应用对肝癌细胞生长抑制作用的影响,并选择高效的治疗组合,研究其凋亡机制。方法:鉴定3组肝癌细胞——MHCC97-H(原肝癌细胞株),HK3细胞(转染空质粒的MHCC97-H细胞)和21543细胞(转染含HBx-shRNA质粒的MHCC97-H细胞);RT-PCR检测RNA干扰对HBx mRNA沉寂作用,CCK8和TUNEL分别检测RNA干扰HBx后化疗药物对MHCC97-H肿瘤细胞生长的抑制及诱导细胞凋亡情况。结果:RT-PCR结果显示,与MHCC97-H细胞组比较,21543细胞的HBx mRNA水平下降约91%,HK3细胞HBx mRNA水平下降不明显;RNA靶向干扰HBx基因后的肝癌细胞(21543细胞)较原肝癌细胞(MHCC97-H细胞)和HK3细胞增殖明显减慢,而后两种细胞差别无统计学意义;3种不同细胞加用3种不同浓度的氟尿嘧啶(0～120mg/L)、顺铂(0～32mg/L)后细胞生长明显减慢并呈浓度依赖性,以RNA靶向干扰HBx基因后的21543细胞生长抑制最明显;相同浓度的氟尿嘧啶对3组不同肝癌细胞均可引起细胞凋亡,以21543细胞凋亡最明显。结论:RNA干扰HBx可明显抑制肝癌细胞的增殖,并增加肝癌细胞对化疗药物的敏感性;RNA干扰HBx基因和化疗药物联合应用使肝癌细胞凋亡更明显,细胞增殖速度明显减慢。

乙肝病毒HBx基因荧光真核表达质粒的构建与鉴定

目的:克隆乙肝病毒HBx基因及构建增强型绿色荧光蛋白-HBx基因(pEGFP-N1-HBx)荧光真核表达质粒并进行表达鉴定。方法:以CH-HEP-1肝癌细胞株基因组DNA为模板PCR法扩增HBx基因,PCR产物测序分析正确后克隆至真核表达载体pEGFP-N1,命名为pEGFP-N1-HBx。将该质粒转染肝细胞株HepG2以RT-PCR及荧光显微镜检测其表达情况。结果:酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含HBx基因,RT-PCR检测和荧光显微镜观察表明构建的pEGFP-N1-HBx在肝癌细胞株HepG2真核细胞中表达,且其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20%～30%。结论:HBx基因克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-HBx构建成功,可用于肝癌发生发展的生物学研究。

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建

目的:通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及pcDNA 3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法:用O liga6.0结合P rim er P rem ier 5.0软件设计特异性引物,通过PCR方法从广西HB sA g阳性病人血清中(血清型A drq+)分离得到的病毒株构建的HBxA g质粒中扩增HBx基因。用DNA star5.01和V ector NT I Su ite 8.0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA 3.1(+)质粒中。结果:成功克隆了基因型C型突变型HBx基因,并构建出真核表达载体pcDNA 3.1(+)-HBx。新基因被G eneB ank接受,在G eneB ank上登录号为AY 839630。序列对比和进化树分析表明,新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性(97.8%),2.2%的变异。结论:从广西HB sA g阳性病人病毒株(血清型A drq+)中发现了新的基因型C型突变型HBx基因(m u tan t genotype C)。pcDNA 3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,将为进一步研究HBx基因在树实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。

乙型肝炎病毒HBx基因的shRNA重组表达载体的构建和鉴定

目的:构建pGenesil-3.1-HBx-shRNA重组表达载体,探讨其作用于HepG2.2.15细胞的生物活性.方法:构建了针对HBx基因的siRNA表达载体,通过电穿孔法转染HepG2.2.15细胞,以荧光显微镜观察细胞的转染效率,QRT-PCR检测细胞中HBx基因的相对表达量,利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测了细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡.结果:酶切和测序鉴定证实构建质粒含有HBx基因,QRT-PCR检测和荧光显微镜观察到构建的pGenesil-3.1-HBx-shRNA可以在HepG2.2.15细胞中表达,HBx基因的表达下降了28%(P<0.05),细胞增殖水平下降了47%(P<0.05),质粒pGenesil-3.1-HBx-shRNA转染后的HepG2.2.15细胞凋亡率显著升高.结论:乙型肝炎病毒HBx基因的shRNA重组表达载体构建成功,沉默HBx基因的shRNA能够抑制HBx基因的表达,且对HepG2.2.15细胞的增殖水平起明显的抑制作用.

HBx基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的:构建携带HBx基因的重组逆转录病毒载体,为进一步研究HBx基因在HBV相关性HCC(原发性肝癌)发病机制中的作用以及建立肝癌动物模型奠定基础。方法:根据基因库中已公布的HBx序列设计引物,采用PCR技术从HBx腺病毒质粒中扩增出HBx基因。将HBx基因克隆到逆转录病毒载体pSEB-HUS质粒中。酶切、PCR及测序鉴定后经脂质体介导转染L02细胞,Western Blotting检测HBx蛋白的表达。结果:PCR、酶切及测序鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒质粒pSEB-HUS中,目的基因序列与GENE BANK报道一致,转染L02细胞后荧光显微镜可观察到GFP的表达。Western Blotting检测可见HBx蛋白的表达。结论:成功构建HBx重组逆转录病毒载体。

HBx基因瞬时转染对SUDHL-4细胞增殖的影响

目的:研究HBx基因瞬时转染对淋巴瘤细胞SUDHL-4增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:用分子克隆方法构建HBx基因的真核载体pc DNA3.1-X,利用脂质体转染法将pc DNA3.1-X转入淋巴瘤细胞SUDHL-4中,构建整合有HBx基因的淋巴瘤细胞株SUDHL-4-HBx,以SUDHL-4及转染空载体的细胞SUDHL-4-con作为对照,利用CCK8法检测细胞转染24、48、72和96 h后的增殖活性,绘制生长曲线;应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况。结果:重组质粒双酶切结果及测序结果表明成功构建pc DNA3.1-X,转染后SUDHL-4细胞有HBx mRNA及蛋白的表达。与SUDHL-4组及SUDHL-4-con组相比,SUDHL-4-HBx组细胞的增殖能力下降,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,凋亡率升高(P<0.05)。结论:瞬时转染HBx基因后,SUDHL-4细胞增殖减缓,细胞周期阻滞于G0/G1期,凋亡率增加。

乙型肝炎病毒HBs、HBx基因与HBVM的相关性及临床意义研究

目的:阐明HB s、HBx基因与HBVM的相关性及临床意义。方法:以HCC s、LC ir、SeCH、CHB以及A SC s作为研究对象,应用EL ISA法检测研究对象血清中HB sA g、HB sA b、HB eA g、HB eA b、HB cA b;应用PCR技术、探针杂交法及免疫化学自显影法定性检测HB s、HBx基因。结果:在研究对象中,HB sA g+HB eA b+HB cA b、HB sA g+HB eA g+HB cA b和HB sA g+HB cA b模式阳性率分别为:53.3%、27.0%和11.8%;除A SC s组外,各临床类型肝病HB sA g+HB eA b+HB cA b模式阳性率均高于HB sA g+HB eA g+HB cA b模式的阳性率,但差别无统计学意义(P>0.05);与A SC s组比较,HCC s组的HBx基因阳性率明显高于A SC s组(P<0.05),其余各组均无明显差别(P>0.05)。与A SC s组比较,LC ir和SeCH组病人中的HB s基因阳性率显著高于A SC s组(P<0.025),其余各组无明显差异(P>0.05);以HB sA g模式作为对照时,各HBVM模式的HB s、HBx基因阳性率与HB sA g模式的阳性率无明显差别(P>0.05);但在HB sA g+HB eA g+HB cA b模式中阳性率显著高于HB sA g+HB eA b+HB cA b模式的阳性率(P<0.001);HB sA g+HB cA b模式中的HBx基因阳性率也显著高于HB sA g+HB eA b+HB cA b模式的阳性率(P<0.001)。结论:HB sA g+HB eA b+HB cA b模式与肝病的发病关系似乎比HB sA g+HB eA g+HB cA b模式更为密切;HBx基因与HCC s的发生存在密切关系,而HB s基因与LC ir、SeCH的发生关系密切。HB s、HBx基因与HB sA g+HB eA g+HB cA b模式关系密切,而HBx基因还与HB sA g+HB cA b模式存在密切关系。

HBx基因通过调节凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值促进人肾小管上皮细胞凋亡

目的探讨HBV x基因(HBx)对人肾小管上皮细胞株(HK-2)增殖和凋亡的影响及机制。方法采用脂质体转染法,将质粒pCDNA3.1(+)HBx转染至HK-2细胞株。细胞实验分5组,对照组、转染空质粒pCDNA3.1(+)组、转染pCDNA3.1(+)HBx24 h组、转染pCDNA3.1(+)HBx 48 h组、转染pCDNA3.1(+)HBx 72 h组。CCK8方法检测HBx对各组细胞增殖抑制率的影响;用透射电镜及AV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。应用免疫细胞化学及免疫印迹检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2水平。结果经酶切鉴定及测序结果显示pCDNA3.1-HBx构建成功。与对照组相比,空质粒组细胞存活率及凋亡率无明显差异,凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值无明显差异(P>0.05)。转染HBx基因24 h后,细胞增殖明显受抑,凋亡率显著增加,Bax/Bcl-2比值开始增高。至72 h,细胞增殖抑制率最高达到(35.27±1.10)%,细胞凋亡率达到最高为(23.80±2.16)%,Bax/Bcl-2比值显著增高。与对照组及其他各组比较,具有显著性差异(P<0.05)。结论 HBx基因可抑制HK-2细胞增殖并通过提高凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2比值诱导其凋亡。

原位杂交检测肝癌组织c－myc和HBx基因的表达

应用光敏生物素标记基因探针原位杂交技术（ＤＮＡ－ｍＲＮＡ）检测２３例新鲜肝癌和癌旁组织中的ｃ－ｍｙｃ和ＨＢｘ基因表达状况。结果发现，１１例肝癌和癌旁组织ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ和ＨＢｘｍＲＮＡ均为阳性，６例均为阴性，５例仅ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ阳性１例仅ＨＢｘｍＲＮＡ阳性，Ｘ＾２检验显示肝癌组织ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ和ＨＢｘｍＲＮＡ地明显相关关系（Ｐ〉０．０５）。

siRNA沉默HBx基因对HepG2.2.15细胞迁移能力的影响

乙肝病毒（HBV）感染是肝癌的主要致病因素，HBx在肝癌的发生发展、转移浸润过程中起着很重要的作用。本研究应用RNAi技术沉默HBx基因表达，在体外观察HBx基因对HepG2．2．15细胞迁移能力及DNA合成的影响。

稳定表达HBx基因的HepG2细胞对顺铂敏感性的变化及其机制研究

目的 探讨乙肝病毒x基因(HBx)对肝癌细胞株HepG2化疗敏感性的影响及其机制。方法 1.构建HBx的真核表达载体;2.脂质体法转染HepG2,G418筛选得到稳定表达HBx-ORF的阳性细胞克隆;3.Western blot法检测转染前后磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达变化;4.MTT法检测转染前后HepG2对顺铂的反应,以及用PD98059特异性阻断ERK1/2激活通路后HBx+HepG2对顺铂敏感性的变化。结果 1.稳定表达HBx-ORF的HepG2中p-ERK1/2的表达明显强于阴性细胞;2.稳定表达HBx-ORF的HepG2在2μg/ml顺铂作用24小时后,顺铂对其抑制率为19.45％±2.50,明显低于阴性组的33.15％±2.85和转染空质粒组的30.79％±2.66(P<0.05);用PD98059阻断阳性细胞中ERK1/2的激活之后,相同剂量,时间作用下,对HBx+HepG2的抑制率上升至32.28％±4.22,明显高于阻断前(P<0.05)。结论 HBx通过ERK通路介导肝癌细胞的抗化疗反应,ERK通路有可能成为乙肝后肝癌辅助治疗的靶点。

HBx基因转染对人肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响

目的探讨HBx基因转染对人肝癌细胞系Hep G2细胞增殖的影响。方法用脂质体转染法将HBx真核表达载体pc DNA3/HBx瞬时转入Hep G2细胞(转染HBx细胞组);以转染空载体细胞组和未转染Hep G2细胞组作为对照。以流式细胞仪及荧光显微镜观察各组肝癌细胞增殖情况。结果转染HBx细胞组的Hep G2肝癌细胞生长较其他两组密集。流式细胞仪检测显示转染HBx细胞组的Hep G2细胞较多处于增殖期(G2期细胞占5.68%)。荧光显微镜图像显示转染HBx细胞组处于增殖期的Hep G2细胞比率为47%,转染空载体细胞组为28%,未转染Hep G2细胞组为25%;转染HBx细胞组Hep G2细胞处于增殖期的比率与其他两组比较有统计学差异(P均<0.05)。结论 HBx基因转染能促进人肝癌细胞系Hep G2细胞增殖。

核苷(酸)类似物治疗显效的慢乙肝患者外周血单个核细胞中HBx基因检测及临床意义

目的对采用核苷(酸)类似物(NAs)治疗显效慢乙肝患者外周血单个核细胞中的HBx基因进行检测,并对检测结果展开分析,探究HBx基因的临床意义。方法选取2015年4月~2017年8月天津市第二人民医院采用NAs治疗的显效慢乙肝患者70例作为研究对象,70例患者根据疾病病情分为A、B、C三组,A组为显效慢乙肝患者(23例),B组为乙肝后肝硬化患者(25例),C组为肝细胞性肝癌患者(22例)。对全部患者外周血单个核细胞中的HBx基因展开检测,并对检测结果展开分析。结果本次研究选取的70例显效慢乙肝患者经检测发现外周血单个核细胞中存在HBx基因的患者为43例,即检出率为61.43%,且B、C两组患者外周血单个核细胞中HBx基因的检出率显著高于A组(P<0.05);在A、C两组部分患者中检测发现HBx基因存在热点突变,即A389T/G391A、T380C,且C组患者A389T/G391A热点突变的出现率显著高于A组(P<0.05)。结论在采用NAs治疗的显效慢乙肝患者中,外周血单个核细胞中HBx基因的检出率因病症发展情况的不同而存在一定差异性,其中乙肝后肝硬化及肝细胞性肝癌患者的检出率较高,显效慢乙肝患者及肝细胞性肝癌患者的HBx基因存在热点突变,且后者出现的可能性远高于前者。

HBx基因转染对Huh7细胞中基因转录的影响

目的:研究HBx基因对肝癌细胞Huh7中基因表达的影响,为探讨HBx在肝癌发生发展中的分子机制提供依据。方法:以pcDNA3.1b质粒为载体,将HBx转入Huh7细胞中,同时将pcDNA3.1b作空白对照。用Western印迹法证实基因转染成功。应用Affymetrix公司的人类全基因组寡核苷酸基因芯片分析转染HBx基因前后,Huh7细胞的基因表达谱。随机选择转染前后有明显差异的6个基因(3个上调,3个下调),用荧光定量PCR技术进行验证。结果:从基因芯片结果分析中发现,与对照组相比,HBx转染后Huh7细胞中明显上调的基因有88个,下调的基因有111个,这些差异基因的功能涉及多个方面。结论:HBx基因对肝癌细胞的影响是双向的,既有转录激活的作用,同时又有转录抑制的功能。这些数据对于理解HBx基因在肝癌发生发展中的作用具有重要的参考意义。

转HBx基因肝癌细胞增殖与抗凋亡特性研究

:【目的】研究转HBx基因肝癌细胞增殖与拮抗凋亡特性 ,探讨肝癌恶性表型的分子基础。【方法】以携HBx基因重组逆转录病毒感染QGY770 1肝癌细胞 ,G418筛选 ,PCR与RT PCR鉴定 ;流式细胞仪 (FCM)检测细胞增殖周期 ;用阿霉素诱导细胞凋亡 ,FCM定量检测。【结果】QGY770 1肝癌细胞经HBx基因转染后 ,G418筛选 4～ 6周获阳性克隆株QGY/HBx ,PCR与RT -PCR分别证实细胞有HBx基因整合与HBxmRNA表达 ;细胞周期分析结果表明 ,QGY/HBx细胞的细胞周期进程明显加快 ,并可明显抵制阿霉素的凋亡诱导作用。【结论】HBx基因可加速肝癌细胞周期的进程 ,并增强肝癌细胞的抗凋亡能力。

携HBx基因逆转录病毒载体的构建

【目的】构建携HBx基因的逆转录病毒载体 ,为研究HBx基因与肝癌生物学行为间的关系提供基础。【方法】采用PCR技术从HBV全基因组中扩增HBx基因 ;将HBx基因亚克隆至质粒pLNSX ,构建质粒 pLNSHBx ,磷酸钙 DNA共沉淀法将重组体导入包装细胞系PA317,检测培养上清病毒滴度。【结果】应用PCR技术成功地从HBV基因组中克隆出全长HBx基因 ,并经序列分析证实 ;建立了产病毒细胞株PA317/HBx ,检测其培养上清病毒滴度为 8.9× 10 4 CFU ,PCR证实重组病毒中含有HBx基因。【结论】成功构建了携HBx基因的较高滴度逆转录病毒载体。