肿瘤相关抗原基因HCA520重组蛋白的表达纯化及其肝癌患者血清中相应抗体的分析

HCA5 2 0是用SEREX(serologicalidentificationofrecombinantcDNAexpressingcloning)方法 ,即用肝癌病人血清从肝癌组织cDNA表达文库中筛选得到的肝癌相关性抗原编码基因 .利用RT PCR技术检测了HCA5 2 0mRNA在各种组织中的分布情况 ,构建了GST融合表达载体并且用亲和层析的方法纯化表达的融合蛋白 .最后用Western印迹检测了重组蛋白的免疫反应性 ,用斑点印迹检测了肝癌病人血清中HCA5 2 0的天然抗体的存在情况 .结果表明 ,HCA5 2 0在各种组织中呈丰度差异分布 ,构建好的pGEX 4T 3重组载体经IPTG诱导后高效表达GST HCA5 2 0融合蛋白 ,其分子量约 4 9kD .经GST Agarose亲和层析 ,重组蛋白得到高度纯化 .Western印迹证实 ,纯化蛋白为目的重组蛋白 ,重组蛋白具有与天然蛋白相同或相似的免疫反应性 .斑点印迹分析表明 ,2 0份肝癌病人血清中有 1份HCA5 2 0抗体阳性 ,而 4份正常人均为阴性 .HCA5 2 0的足量提供 ,可用以研究其在致癌中的作用 ,并可以免疫动物制备抗体 .它作为抗原 ,分析其抗体在不同肿瘤病人中的表达情况 。

肝细胞癌相关抗原编码基因HCA520与钙离子的结合分析

目的 :分析肝细胞癌相关抗原编码基因HCA52 0与钙离子的关系。方法 :通过PCR获得目的基因 ,构建至原核表达载体pGEX 4T 3中。在大肠杆菌中诱导表达后 ,用亲和层析法进行纯化。Westernblot对所获蛋白进行鉴定 ,Dotblot分析GST HCA52 0融合蛋白与钙离子的关系。结果 :琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定表明 ,重组原核表达载体pGEX 4T 3中 ,HCA52 0基因的插入方向及序列完全正确。Westernblot分析显示 ,纯化的蛋白均含有GST部分 ,是所需的目的蛋白。HCA52 0融合蛋白能够以剂量依赖的方式与钙离子结合。结论 :HCA52 0基因原核表达的蛋白能够与钙离子结合 。

生物信息学在新基因HCA520研究中的作用

利用生物信息学对新基因HCA5 2 0的基因和蛋白序列进行分析 ,探讨生物信息学在新基因研究中的作用。以人类基因组数据库为基础 ,利用电子PCR和SAGE对HCA5 2 0进行染色体定位和组织表达分布分析 ;BLAST程序进行HCA5 2 0的基因结构分析和相似序列搜索 ;ORFfinder和GeneRunner3.0 5程序对HCA5 2 0编码蛋白进行序列预测和功能分析。RT PCR检测HCA5 2 0的组织表达谱。通过以上分析得出HCA5 2 0的全长cDNA为 2 396bp ,定位于染色体 16 p12 .2 ,其最长的开放读码框架为 5 91bp ,编码 196个氨基酸。编码氨基酸含有典型的EF hand保守序列 ,与CHP具有很高的同源性 ,为一胞内蛋白。在多种组织中有表达。提示HCA5 2 0可能是新的钙离子结合蛋白家族成员 ,可能通过调节Na+ /H+ 交换子的活性影响细胞的生物学功能。

肿瘤相关抗原HCA520真核表达载体的构建及细胞内表达的定位分析

应用PCR技术获得肿瘤相关抗原HCA520编码基因,构建至pGEM-T Easy载体,测序正确后,亚克隆至pEGFP-N1载体,1％的琼脂糖电泳得到两条带,与预期结果相同;鉴定正确的基因一过性转染至CHO细胞,共聚焦显微镜观察HCA520基因编码蛋白主要位于胞浆靠近胞膜处,为HCA520功能的进一步研究打下了基础。

白细胞介素-6参与肿瘤相关抗原HCA520对HEK293细胞的促增殖作用

目的:研究肿瘤相关抗原HCA520对HEK293细胞增殖的影响,获得HCA520生物学功能的初步提示。方法:构建pcDNA3 HCA520 flag真核表达载体转染HEK293细胞并建立稳定转染细胞系,利用MTT实验观察HCA520对HEK293细胞增殖速率的调节。通过RT PCR检测可能参与HCA520对HEK293细胞增殖促进作用的相关分子,并用3 (4, 5 二甲基2 噻唑) 2, 5 二苯基溴化四唑(MTT)实验进一步验证目标分子对HEK293细胞增殖的作用。结果:MTT实验结果显示HCA520显著提高HEK293细胞的增殖速率,HCA520上调白细胞介素6在HEK293细胞中的表达,后者部分参与HCA520对HEK293细胞的促增殖作用。结论:HCA520对HEK293细胞的增殖具有促进作用,并推测可能通过促进细胞恶性增殖在肿瘤发生中发挥作用。

HCA520, A NOVEL TUMOR ASSOCIATED ANTIGEN, INVOLVED IN CELL PROLIFERATION AND APOPTOSIS

Objective: Tumor associated antigen encoding gene HCA520 (AF146019) was identified by screening a human hepatocellular carcinoma expressing cDNA library using SEREX technique. In this experiment we studied the effect of HCA520 on cell proliferation and apoptosis. Methods: Gene HCA520 was gained by PCR and transfected into 293 cells. The stable expression cells were obtained by G418 selection. The cell proliferation was measured by [3H]-TdR uptake and apoptosis assay was measured by FACS. Results: Eukaryotic expression plasmid pcDNA3-HCA520 was constructed and its stable transfectants were obtained. Overexpression of HCA520 inhibited the cell proliferation and enhanced cell apoptosis after serum deprivation. Conclusion: HCA520 is a novel tumor associated antigen that can affect cell proliferation and apoptosis.

妇科

c-myc反义寡核苷酸对卵巢癌细胞COC1／DDP顺铂耐药的逆转作用,11种化疗药物对卵巢癌细胞的抑制作用及其对有核细胞毒性的研究,氨磷汀对卵巢癌化疗患者的保护作用25例分析,肿瘤相关抗原HCA520在卵巢癌组织细胞中的表达及意义,CD82和CD63及CD9基因与卵巢癌进展的相关性研究,UPA蛋白表达与上皮性卵巢癌生物学行为的关系,