自制ISCOMATRIX与CpG联合的HCA587蛋白疫苗的制备及其免疫效应评估

目的确定自制免疫刺激复合物(ISCOMATRIX)作为HCA587蛋白疫苗佐剂的有效剂量,并探讨其与CpG联合作为HCA587蛋白疫苗佐剂的免疫效力和肿瘤治疗效果。方法应用透析法将Quil A、胆固醇和磷脂制备成ISCOMATRIX,经磷钨酸负染并采用透射电子显微镜观察自制ISCOMATRIX的结构。建立小鼠免疫模型,将联合CpG的HCA587蛋白疫苗与不同剂量的自制ISCOMATRIX佐剂混合,经尾根部皮下免疫小鼠;采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测产生IFN-γ的脾细胞频数,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清HCA587特异性抗体水平。在小鼠右侧胁腹部皮下接种B16-HCA587肿瘤细胞建立荷瘤小鼠模型,按照处理方式不同将小鼠分为HCA587蛋白疫苗治疗组(接种100μL包含CpG与最佳剂量的自制ISCOMATRIX的HCA587蛋白疫苗)与PBS对照组(注射100μL的无菌PBS),使用游标卡尺测量肿瘤大小。结果自制ISCOMATRIX佐剂呈典型的蜂窝状结构,直径20~30 nm,大小均一。12、36μg(QuilA浓度分别为0.012%、0.036%)的自制ISCOMATRIX组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的频数与商品化ISCOMATRIX阳性对照组比较,差异无统计学意义(均P>0.05),且显著高于CpG+36μg ISCOM对照组与PBS组(均P<0.0001);5μg与18μg自制ISCOMATRIX组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞频数,高于CpG+36μg ISCOM对照组与PBS组(均P<0.0001),但低于商品化ISCOM组(P=0.004)。12、18与36μg自制ISCOMATRIX组的血清HCA587抗体水平与商品化ISCOM阳性对照组比较,差异无统计学意义(均P>0.05);与PBS组相比,12μg自制ISCOMATRIX组1×10^(4)倍稀释血清的抗体滴度显著升高(P=0.0062)。与PBS对照组相比,HCA587蛋白疫苗治疗组肿瘤生长速度减缓,且第35天测量时肿瘤大小显著较小(P=0.0181)。结论以12μg自制ISCOMATRIX作为佐剂联合CpG制备的HCA587蛋白疫苗能诱导有效的免疫应答,并抑制荷瘤小鼠的肿瘤的生长,具有一定的肿瘤治疗作用。

HCA587蛋白疫苗诱导的抗体与抗肿瘤相关性的研究

目的检测HCA587蛋白疫苗在小鼠体内诱导的抗体水平,并分析抗体效价与抗肿瘤作用的相关性。方法按照不同的免疫方案以液体形式尾根部皮下注射给小鼠,将肿瘤细胞在小鼠左侧胁腹部皮下接种以建立肿瘤模型。用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测抗体总IgG或IgG各亚型的水平,并用游标卡尺测量肿瘤大小。结果 HCA587蛋白疫苗诱导的抗HCA587抗体总IgG效价高于1∶1 024×104,其水平与肿瘤大小呈显著负相关。γ-干扰素(IFN-γ)敲除后,该疫苗的抗肿瘤效果完全消失,同时抗HCA587的IgG2a亚型效价显著下降。结论 HCA587蛋白疫苗诱导的IgG抗体效价很高,具有一定的抗肿瘤作用,其中IgG2a可能与抗肿瘤关系密切。

HCA587蛋白疫苗的抗肿瘤效应及效应细胞亚群

目的探讨HCA587蛋白疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应并揭示抗肿瘤效应的免疫细胞亚群。方法在C57BL/6小鼠左侧胁腹部皮下接种肿瘤细胞建立肿瘤模型,给予HCA587蛋白疫苗等免疫策略治疗2次,观察抗肿瘤效果。用苏木精-伊红(HE)染色法分析疫苗治疗后肿瘤组织中淋巴细胞的浸润。用SDS-PAGE电泳分析自行制备的抗CD4和CD8分子单抗的相对分子质量和纯度,并用流式细胞术对其体内阻断效果进行鉴定。将上述单抗腹腔内注射入小鼠体内,以实现免疫细胞在体清除。结果与单一蛋白治疗组、佐剂对照组相比,HCA587蛋白疫苗具有显著的抗肿瘤作用(P<0.05)。在HE染色中,HCA587蛋白疫苗治疗后肿瘤局部可见大量的免疫细胞浸润。经流式细胞术鉴定,自行制备、纯化的抗CD4和CD8分子单抗在体能完全清除相应的CD4+T和CD8+T细胞亚群。当在体清除CD4+T细胞后,HCA587蛋白疫苗的抗肿瘤效应完全消失,而CD8+T细胞的清除不影响其抗肿瘤效应。结论 HCA587蛋白疫苗具有显著的抗肿瘤效应,其诱导的CD4+T细胞在抗肿瘤效应中起着至关重要的作用。

HCA587/MAGE-C2蛋白联合CFA和CpG佐剂的免疫应答及抗肿瘤效应

目的:探究HCA587/MAGE-C2蛋白在不同免疫策略下诱导抗原特异性免疫应答的能力及在小鼠模型中的抗肿瘤作用。方法:HCA587蛋白与弗氏完全佐剂(CFA)/弗氏不完全佐剂(IFA)、不同剂量CpG ODN 1826(CpG)联合免疫C57BL/6J小鼠,比较不同方案诱导的细胞免疫和体液免疫水平。酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测脾细胞产生IFN-γ的频率;ELISA检测抗HCA587特异性抗体;流式细胞术分析胞内细胞因子染色(ICCS)。将B16-HCA587肿瘤细胞皮下接种于C57BL/6J小鼠右侧胁腹部建立荷瘤小鼠模型,采用免疫比较方案中细胞和体液免疫应答最强的策略进行治疗;游标卡尺测量肿瘤体积;Log-rank检验评估生存曲线。结果:HCA587蛋白联合CFA和50μg CpG免疫方案诱导出能分泌抗原特异性IFN-γ的脾细胞频数最多,诱导抗HCA587的IgG抗体滴度最高,诱导出的IFN-γ^(+)CD4^(+)T细胞比例最高(P<0.05)。肿瘤治疗模型中,HCA587蛋白联合CFA和50μg CpG可显著抑制肿瘤生长(P=0.026),但Log-rank检验显示其对生存期无明显影响(P>0.05)。结论:佐剂CFA和50μg CpG联合组成的HCA587蛋白疫苗在小鼠模型中能诱导强大的细胞免疫应答和体液免疫应答,并具有一定抗肿瘤作用,为肿瘤抗原蛋白疫苗临床前研究提供了新的实验数据。

HCA587/MAGE-C2蛋白疫苗免疫记忆效应及应答持久性的研究

目的探究HCA587/MAGE-C2蛋白疫苗的免疫记忆效应,并监测其应答的持久性。方法在C57BL/6小鼠右侧胁腹部皮下接种B16-HCA587肿瘤细胞建立荷瘤小鼠模型。采用酶联免疫斑点试验(ELISpot)法检测脾细胞产生IFN-γ的频率;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测抗HCA587特异性抗体;采用游标卡尺测量肿瘤大小。结果接种B16-HCA587肿瘤细胞后,第7天给予HCA587蛋白疫苗治疗效果优于第12天,表现为荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,生存期显著延长。该疫苗二次免疫后第14天接种B16-HCA587肿瘤细胞预防效果优于第7天,表现为疫苗预防组小鼠第60天未成瘤率100%,到120天未成瘤率仍有83%(P<0.0001)。该疫苗诱导的细胞免疫应答可在小鼠体内持续至少24周,抗HCA587抗体滴度在24周仍保持较高水平。在首次治疗模型中疫苗治疗后40 d仍未成瘤的小鼠,再次接受3倍于首剂量的肿瘤细胞时,仍可表现出显著的肿瘤生长缓慢和生存期延长。结论HCA587蛋白疫苗于二次免疫后14天对HCA587阳性的荷瘤小鼠的肿瘤治疗与预防效果强大而特异,而且其持久且高强度的免疫记忆可保护小鼠免受肿瘤的二次攻击。