酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因,为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式,采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白,探讨Hcbp6的生物功能。方法:应用酵母双杂交系统3,构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,在涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD/Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果:筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白,包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白。结论:推测该蛋白可能为一分泌性蛋白,或与分泌蛋白的形成有关,进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨。

HCBP6模拟磷酸化对肝细胞内三酰甘油合成的调控作用

目的探讨HCBP6模拟磷酸化对肝细胞内三酰甘油合成的调控作用,为代谢相关脂肪性肝病的治疗提供分子靶点。方法利用定点突变技术,模拟HCBP6 Ser-10、Ser-151磷酸化与去磷酸化。油红O染色与三酰甘油含量测定检测肝细胞内三酰甘油水平。qRT-PCR及Western blotting检测SREBP1c、ACC1及FASN的表达。双萤光素酶报告基因检测SREBP1c启动子活性。结果HCBP6 Ser-10磷酸化促进三酰甘油生成;HCBP6 Ser-10磷酸化上调SREBP1c、ACC1、FASN基因表达;HCBP6 Ser-10磷酸化增强SREBP1c启动子活性。结论HCBP6 Ser-10磷酸化能明显增强SREBP1c启动子活性,上调SREBP1c-FASN信号通路转导,促进三酰甘油生成。

HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响

目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白- 蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响. 方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体.酶联免疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性. 结果:重组表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6、pcDNA3.1(-)- core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显著的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%. 结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显著的抑制作用.

HCBP6模拟磷酸化重组质粒的构建与亚细胞定位

目的构建HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的绿色荧光蛋白重组质粒,明确其亚细胞定位。方法以构建含有570 bp的HCBP6外显子基因的绿色荧光蛋白重组质粒为基础,应用快速定点突变技术构建HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒。将重组质粒测序并进行序列比对。利用jetPRIME转染体系将HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒转染至细胞中,应用Real-Time PCR技术检测目的基因mRNA的表达,应用Western blot技术检测目的基因蛋白表达,应用荧光显微镜观察HCBP6不同位点磷酸化质粒的亚细胞定位。结果将测序的重组序列与目的基因进行比对,发现重组序列与目的基因完全一致,说明HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒构建成功。Real-Time PCR和Western blot表明,与对照组相比,实验组高表达HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的基因。免疫荧光显微镜可见10Ala主要在细胞质表达,WT、10Asp、151Ala、151Asp主要在细胞核表达。结论构建的HCBP6及HCBP6不同位点模拟磷酸化的重组质粒可成功转染细胞并在细胞中高表达,HCBP6不同位点磷酸化质粒亚细胞定位不同。

HCBP6在原发性胆汁性胆管炎患者中的表达及意义

目的探讨HCBP6在原发性胆汁性胆管炎(PBC)患者中的表达及意义。方法收集PBC患者血清标本60例(PBC血清组)、取10名同期健康体检者外周血标本为正常对照组1,采用ELISA法检测血清HCBP6水平。收集肝穿刺标本40例(PBC肝组织组)、取10例肝移植供肝组织标本作为正常对照组2,采用免疫组织化学染色检测肝组织HCBP6表达,分析HCBP6与肝组织病理分期的相关性。结果PBC血清组HCBP6水平较正常对照组1低(P<0.05)。PBC肝组织组中的HCBP6阳性细胞数量较正常对照组2少(P<0.01),与肝组织病理分期呈负相关(rs=-0.583,P<0.001)。结论HCBP6在PBC患者外周血和肝组织中均呈低表达,提示HCBP6可能在PBC的发病过程中发挥重要作用。

基于HCBP6靶点的8种常用中草药调节糖脂代谢作用及其潜在活性成分的探讨

随着生活水平的提高和工作方式的改变,现代社会人类糖脂代谢异常的发病率越来越高。临床上常通过调整生活方式和/或应用降糖降脂药进行治疗,但目前并没有专门针对糖脂代谢紊乱的药物。丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)是一个新发现的靶点,可依据体内水平振荡调节甘油三酯及胆固醇的含量,从而调节糖脂代谢异常。相关研究表明,人参皂苷Rh2可显著上调HCBP6的表达,但关于中药对HCBP6作用的研究几乎为空白,且HCBP6三维结构信息也未被确定,作用于HCBP6的潜在活性成分的发现研究较为缓慢。因此,该研究首先选择8种常用的调节糖脂代谢异常的中药的总皂苷部位为研究对象,观察其对HCBP6表达的影响,然后采用预测获得的HCBP6三维结构与8种中草药中皂苷类成分进行分子对接,以期快速获取潜在活性单体。结果表明,8种总皂苷部位均有上调HCBP6 mRNA及蛋白表达的作用趋势。其中,绞股蓝总皂苷组上调HCBP6 mRNA的作用最好;人参总皂苷组上调HCBP6蛋白表达的效果最好。利用Robetta网站对蛋白质结构进行预测并通过SAVES对预测的结构进行评估后得到可靠的蛋白结构。同时搜集网站及文献中的皂苷类化合物与预测的蛋白进行对接,发现皂苷类成分与HCBP6蛋白具有良好的结合活性。研究结果为从中药中发现调节糖脂代谢的新药提供了思路和方法。

成军:非酒精性脂肪性肝病新药的研发

记者:请您介绍下您研究的脂肪肝产品“利沃素”是一个什么样的产品?成军教授:“利沃素”是国家正式批准的一款功能性医学食品,成分是人参提取物。目前我们在一定范围内尝试在脂肪肝患者的生活干预方面是否有一些效果。这是我们课题组从发现新基因HCBP6,到产品设计研究了20多年的结果。

丙型肝炎病毒核心蛋白6号结合蛋白基因启动子序列的确定及转录活性鉴定

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白6号结合蛋白基因(Hcbp6)序列表达的调控机制。方法根据软件对启动子的预测,选取翻译起始密码子ATG上游3256bp及下游180bp的DNA序列, 分成5段活性区域,分别以聚合酶链反应技术(PCR),肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增该启动子DNA片段,将其克隆至pCAT3中,构建pCAT3-Hcbp6-p报告基因表达载体,将该质粒分别转染HepG2、NIH3T3细胞,用酶联免疫吸附法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现质粒pCAT3-Hcbp6-1066p和pCAT3-Hcbp6-240p能够指导CAT的表达,其平均吸光度值(A)是pCAT3-basic对照质粒的3.1倍和6.4倍。结论本研究克隆的启动子DNA序列具有转录活性, 这一结果为研究Hcbp6的调节机制,进一步阐明HCV核心蛋白的作用机制奠定了基础。