苦丁冬青苷D对人HCC-1806乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及机制研究

目的探讨苦丁冬青苷D(KD-D)对人HCC-1806乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及机制。方法将人HCC-1806乳腺癌细胞作为研究对象,给予不同浓度KD-D处理后,采用CCK-8法检测细胞存活率;EdU法检测细胞增殖能力;结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力;流式细胞术(Annexin V-FITC/PI法)检测细胞凋亡;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位;免疫荧光法检测细胞Cleaved Caspase-3、LC3、P62蛋白表达;Western Blot法检测细胞Cleaved Caspase-3、Pan-AKT、Phosp-AKT、LC3Ⅱ蛋白表达;自噬双标mRFP-EGFP-LC3腺病毒感染实验检测细胞自噬流。结果与对照组比较,12.5、25、50、100、200、400μmol·L^(-1)KD-D处理HCC-1806细胞24、48 h后,随着给药浓度增大和处理时间延长,细胞活性显著降低(P<0.001),细胞内吸光度值显著降低(P<0.001),细胞增殖受到抑制;60、80μmol·L^(-1)KD-D组的细胞克隆形成计数显著减少(P<0.001);50、100、150μmol·L^(-1)KD-D组细胞的早期及晚期凋亡比例均显著升高(P<0.05,P<0.001);40、60、80μmol·L^(-1)KD-D组的红色荧光比例显著下降(P<0.001),绿色荧光比例显著升高(P<0.01,P<0.001),HCC-1806细胞线粒体膜电位下降;60、80、100μmol·L^(-1)KD-D组细胞的Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著上调(P<0.001),60μmol·L^(-1)KD-D组细胞的Pan-AKT、Phosp-AKT蛋白表达均显著上调(P<0.001);60μmol·L^(-1)KD-D组细胞的LC3蛋白荧光小点数量显著增加(P<0.001),P62蛋白平均荧光强度显著降低(P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P<0.001),自噬小体及自噬溶酶体数量显著增加(P<0.01,P<0.001),自噬流激活。与60μmol·L^(-1)KD-D组比较,KD-D+AKT抑制剂(Afuresertib)组细胞的Cleaved Caspase-3、Pan-AKT蛋白表达显著下调(P<0.01,P<0.001),Phosp-AKT蛋白表达显著上调(P<0.001)。结论KD-D能抑制人乳腺癌HCC-1806细胞增殖,并诱导其发生凋亡和自噬,KD-D诱导HCC-1806细胞凋亡可能与激活AKT信号影响Cleaved Caspase-3表达有关。

人肝癌细胞系HCC-9724的建立及其生物学特性

目的 建立一株肝癌细胞系 HCC- 972 4,为肝癌研究提供实验模型 .方法 无菌切除肝癌手术标本 ,6只裸鼠右后肢皮下包埋 ,体内连续传 3代后 ,取移植瘤体外培养 ,绘制细胞生长曲线 ,光镜、电镜观察细胞形态 ,并进行细胞周期和染色体核形分析 ,用免疫荧光法测定荷瘤鼠中 AFP的表达 .结果 移植模型原代获得率为 33.3% ,潜伏期为 5 2 d,自第 3代后肿瘤获得率为 10 0 .0 % ,潜伏期为 16 d,该模型移植瘤具有生长稳定 ,移植成功率高 (10 0 % ) ,潜伏期短 (10 d) ,无自发消退等特点 ,裸鼠移植瘤标本体外培养得到肝癌细胞系 HCC-972 4(简称 H) ,其形态结构 ,排列方式和移植瘤的分化程度与原发瘤保持一致 ,且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型 ,众数维持在 6 2～ 6 6之间 ,占 75 .0 % ,细胞周期分析 G1 期5 3.5 % ,G2 期 19.5 % ,S1 期 2 7.0 % ,细胞群体倍增时间为 2 3d,建立的裸小鼠人肝癌模型具有典型的肝细胞癌特征 ,持续分泌甲胎蛋白 (AFP) .结论 通过裸鼠体内移植瘤建立的肝癌细胞系 HCC- 972 4,与原发癌保持相同的生物学特性 ,体外连续传代 6 mo以上 ,细胞形态不变 ,生长周期恒定 。

利用自体的人肝癌细胞系HCC-9724诱导特异性CTL

目的 :用自体的人肝癌细胞系诱导对肝癌细胞具有特异性杀伤作用的T淋巴细胞。方法 :分离肝癌患者外周血淋巴细胞 (PBL) ,在 5 0U/mlIL - 2存在下与经照射的自体肝癌细胞系共刺激 ,进行筛选性的混合淋巴细胞肿瘤细胞培养 (MLTC) ,直接免疫荧光法分析其细胞表型 ,51Cr释放试验检测效应细胞的杀伤效应。结果 :淋巴细胞明显增殖 ,细胞变大呈豆芽状。细胞毒性实验证明该细胞对HCC - 972 4有特异性杀伤作用 ,而对K5 6 2细胞没有杀伤作用。结论 :利用同体肝癌细胞系HCC - 972 4作为刺激细胞反复诱导肝癌患者能产生肝癌特异性的CTL。推测在刺激及培养条件适宜时 ,人外周血中较少的CTL前体细胞 (CTLp)

乙醇诱导的肝癌细胞HCC-9204凋亡及其与Bax和Bcl-2蛋白的关系

目的探讨乙醇对肝癌细胞凋亡的诱导作用及其与凋亡相关基因bax和bcl-2表达的关系。方法用噻唑蓝(MTT)法检测浓度分别为20～100 mL/ L的乙醇对肝癌细胞系HCC-9204的杀伤作用。然后，用60 mL/ L乙醇作用6 h诱导HCC-9204细胞凋亡。以May-Grunwald-Giemsa (MGG)染色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞术分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化。用免疫细胞化学染色图象分析法，检测诱导凋亡前、后Bax和Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果随着乙醇浓度的增加，其对HCC-9204细胞的杀伤作用逐渐增强。60 mL/ L乙醇可使HCC-9204细胞发生明显的细胞凋亡的形态学变化，并且大部分细胞为TUNEL阳性着色。流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰。诱导凋亡后的HCC-9204细胞Bax蛋白的表达水平明显增高，而Bcl-2在诱导凋亡前、后的HCC-9204细胞中均未见表达。结论低浓度乙醇对肝癌细胞HCC-9204具有明显的凋亡诱导作用，其凋亡的发生与Bax蛋白表达水平的增高有关。

新建肝癌细胞系(HCC-9810)的初步观察

目的 建立山东地区的肝癌细胞系,并研究其生物学特性.方法 将临床获取肝癌标本用组织块法进行体外培养,观察肝癌细胞的形态学、核型、增殖动力学和AFP功能.结果 肝癌细胞系(HCC-9810)具有典型的上皮细胞特征,染色体数目22～116,细胞倍增时间约20.4h.结论提示HCC-9810是一株新建肝癌细胞系,可作为进一步肝癌研究的模型.

人肝细胞肝癌细胞系HCC-9903生物学特性的初步观察

目的 :新建一株人肝癌细胞系 ,为肝癌研究提供新的实验模型。方法 :用组织块法培养 ,并按细胞系建立标准检测细胞的一系列生物学特性。结果 :细胞维持培养 15个月 ,传代 10 0代 ,细胞形态及超微结构具有恶性细胞的特征 ,45代细胞的倍增时间为 2 1 3h ,细胞能在软琼脂上生长 ,形成集落 ,染色体众数60～ 67条 ,主干系为亚三倍体。 1q(i) 和t(6,11)为其标记染色体 ,细胞对刀豆球蛋白有凝集反应 ,5× 10 6 细胞接种于裸鼠皮下 ,肿瘤呈进行性生长。结论 :该细胞系符合建系标准 ,是一株新建的肝癌细胞系。

乙醇诱导肝癌HCC-9204细胞凋亡的研究

目的 :探讨乙醇对肝癌细胞系HCC 92 0 4凋亡的诱导作用 ,建立乙醇诱导肝癌细胞凋亡的模型。方法 :用噻唑蓝 (MTT)法检测浓度分别为 2 %～ 10 %的乙醇对HCC 92 0 4的杀伤作用。然后用 6%乙醇作用 6h诱导HCC 92 0 4细胞凋亡。以透射电子显微镜、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)法和流式细胞术分别检测调亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化。结果 :乙醇对HCC 92 0 4细胞的杀伤作用随浓度的增加而增强。 6%乙醇可使HCC 92 0 4细胞产生明显的凋亡形态学变化 ,大部分细胞为TUNEL阳性 ,并且流式细胞仪分析可见明显的亚二倍体凋亡峰。结论 :低浓度乙醇能有效诱导HCC 92 0

JA_1对体外培养肝癌细胞线粒体膜电位及wt-p53基因表达的影响

为探索梯度浓度的JA1对体外培养人肝癌细胞株(HCC-9724)的细胞周期、细胞线粒体膜电位和wt-p53蛋白表达的影响.采用流式细胞技术和体外细胞培养技术,发现经JA1处理后的细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞在G1被阻滞.细胞线粒体膜电位(ΔΨm)明显下降,且表现出剂量和时间效应关系.而wt-p53蛋白阳性细胞百分率则随时间延长而逐渐增加.JA1诱导了HCC-9724细胞线粒体膜电位的下降和细胞凋亡,而wt-p53蛋白表达的增强则是其诱导HCC-9724细胞凋亡的重要分子机制之一.

27-P-CAUA通过抑制HER2/PI3K/AKT信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡和线粒体自噬

目的探讨大叶冬青叶中三萜类活性成分27-P-香豆酰基-乌索酸(27-P-CAUA)对乳腺癌细胞增殖抑制的作用机制。方法27-P-CAUA处理HCC-1806细胞24、48、72 h后,CCK-8法检测HCC-1806细胞存活率;集落克隆法检测27-P-CAUA对细胞的增殖抑制作用;JC-1检测线粒体膜电位改变;流式细胞术检测细胞凋亡情况;细胞免疫荧光观察C-Caspase-3、P62表达;氯喹预处理后,Western blot观察27-P-CAUA对LC3I/II、P62以及HER2信号通路蛋白的影响。结果CCK-8和集落克隆结果显示,随着药物浓度增加和时间延长,27-P-CAUA对HCC-1806乳腺癌细胞的抑制作用逐渐增强(P<0.01),24、48、72 h的IC50值分别为83.671、49.479、19.578µmol/L;JC-1检测结果显示,线粒体膜电位改变明显(P<0.01);流式细胞术结果显示,27-P-CAUA可诱导细胞发生凋亡,细胞早期调亡比率增加3.34%;免疫荧光结果显示,C-Caspase-3表达增强,促进细胞凋亡,40µmol/L 27-P-CAUA能显著诱导细胞凋亡(P<0.01)。Western blot和细胞免疫荧光结果显示,27-P-CAUA降低LC3II表达,导致P62降解,诱导自噬发生。经氯喹预处理后,27-P-CAUA诱导自噬可被逆转。此外,27-P-CAUA可抑制细胞内Her2及AKT蛋白的磷酸化,细胞内的Her2以及磷酸化AKT蛋白表达逐渐减少(P<0.01)。结论27-P-CAUA可通过抑制HER2/PI3K/AKT信号通路,抑制HCC-1806细胞增殖,诱导细胞发生线粒体自噬和凋亡。

阿霉素诱导人肝癌细胞株HCC－9204肝癌细胞凋亡的实验研究

阿霉素诱导人肝癌细胞株ＨＣＣ－９２０４肝癌细胞凋亡的实验研究张晓东，王文亮（西安病理学教研室西安７１００３３）关键词肝细胞瘤；凋亡；阿霉素中图号Ｒ７３－３作者应用抗癌药阿霉素（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）成功地诱导培养的人肝癌细胞株ＨＣＣ－９２０４肝癌细胞...

乙醇诱导的肝癌细胞HCC—9204凋亡及其与Bax和Bcl—2蛋白的关系

［杨连君，王文亮，司晓辉. 细胞与分子免疫学杂志，2001;17（4）：315-317］ 目的探讨乙醇对肝癌细胞凋亡的诱导作用及其与凋亡相关基因bax和bcl-2表达的关系. 方法用噻唑蓝(MTT)法检测浓度分别为20～100 mL·L-1的乙醇对肝癌细胞系HCC-9204的杀伤作用. 然后，用60 mL·L-1乙醇作用6 h诱导HCC-9204细胞凋亡. 以May-Grunwald-Giemsa (MGG)染色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞术分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化. 用免疫细胞化学染色图像分析法，检测诱导凋亡前、后Bax和Bcl-2蛋白表达水平的变化. 结果随着乙醇浓度的增加，其对HCC-9204细胞的杀伤作用逐渐增强. 60 mL·L-1乙醇可使HCC-9204细胞发生明显的细胞凋亡的形态学变化，并且大部分细胞为TUNEL阳性着色.流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰. 诱导凋亡后的HCC-9204细胞Bax蛋白的表达水平明显增高，而Bcl-2在诱导凋亡前、后的HCC-9204细胞中均未见表达. 结论低浓度乙醇对肝癌细胞HCC-9204具有明显的凋亡诱导作用，其凋亡的发生与Bax蛋白表达水平的增高有关. (何扬举)

Bax对HCC-9204细胞系的凋亡及化疗敏感性的影响

目的研究Bax对HCC-9204细胞系凋亡和对阿霉素敏感性的影响。方法采用脂质体转染法将Bax基因转入HCC-9204细胞中。免疫组织化学分析Bax在HCC-9204细胞中的表达,TUNEL及细胞周期分析细胞凋亡,MTT实验判断肿瘤细胞的活力。结果免疫组化结果显示转染Bax基因的HCC-9204/Bax细胞的Bax表达显著增加。TUNEL检测显示,HCC-9204/Bax细胞的凋亡指数在ZnSO4诱导后24、48h明显增加(3·6±5·3vs27·2±10·5,t=63·45,P<0·05;4·2±4·1vs32·3±8·6,t=93·27;P<0·05),流式细胞仪分析显示,诱导后48h出现显著的“亚二倍体峰”。MTT实验显示Bax基因的过表达能够降低阿霉素处理后的细胞活力,呈时间依赖性。结论Bax基因不仅可以诱导HCC-9204细胞的凋亡,而且能够增加HCC-9204细胞对阿霉素杀伤作用的敏感性。

人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214的建立及其生物学特性

目的 建立人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214,为子宫颈癌研究提供实验模型。方法无菌切除人子宫颈癌的手术标本,用组织块贴壁法体外培养,连续传代稳定生长后,绘制细胞生长曲线。采用光镜、电镜观察细胞形态,并进行细胞周期和染色体核形分析。用免疫组化法测定细胞系肿瘤标记物的(ER、PR、Keratine、PCNA)表达情况。结果组织块贴壁法体外培养获得人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214(简称H),细胞维持培养16个月,传代131代,生长稳定,群体倍增时间为35.48 h,细胞呈上皮镶嵌状贴壁生长,趋向复层生长,无接触抑制。超微结构显示,具有典型的桥粒结构和较多的张力原纤维。染色体数目35～156条,主流范围58～80条(64.8％),结构为人类染色体。细胞的肿瘤标记物(ER、PR、Keratine、PCNA)检测呈高表达,DNA指数为1.931。裸鼠移植瘤组织病理形态学与患者原始肿瘤一致,无血清培养成功。结论通过组织块贴壁法体外培养建立的人子宫颈鳞状细胞癌细胞系HCC-0214,与原发癌保持相同的生物学特性,体外连续传代16个月以上,细胞形态不变,生长周期恒定,可望作为一个稳定的细胞系。

Bax基因的过表达上调HCC-9204细胞系对阿霉素的敏感性

目的 探讨Bax基因的过表达是否能够调节HCC 92 0 4细胞系对阿霉素的敏感性。方法 采用一种可诱导性表达系统、MT Ⅱ调节系统 ,在外加锌离子 (ZnSO4,10 0 μmol/L)的条件下 ,诱导Bax基因过表达。以克隆形成实验来判断Bax是否能够降低阿霉素处理后肿瘤细胞的克隆存活率。以MTT实验来反映细胞活力的改变。凋亡性细胞死亡的鉴定是通过形态学标准并结合TUNEL和细胞周期的分析加以证实。结果 阿霉素能够显著诱导HCC 92 0 4细胞发生凋亡。TUNEL染色显示典型的凋亡特征如新月体样或环状染色体边集于核膜 ,胞浆皱缩并且“发泡”。流式细胞仪分析显示 ,在处理后 2 4h出现显著的亚二倍体峰。Bax能够显著降低阿霉素处理组的克隆存活率 ,Bax也能够降低药物处理后的细胞活力 ,呈时间依赖性。结论 Bax基因的过表达能够增加HCC 92 0

COX-2抑制剂NS-398对肝癌细胞放射增敏作用的实验研究

目的探讨环氧合酶-2（COX-2）抑制剂NS-398对肝癌细胞系HCC-9810的放射增敏作用及其机制。方法MTT实验测定NS-398对肝癌细胞系HCC-9810细胞毒性;成克隆实验检测NS- 398对HCC-9810的放射增敏作用;电镜观察细胞形态学改变;流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡率;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、FCM观察Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达。结果NS-398对HCC-9810细胞毒性呈现浓度、时间依赖性。10μmol/L NS-398作用24 h细胞增殖抑制率仅为3%,由D_q计算增敏比（SER）为1．29,细胞存活曲线“肩区”减小。NS-398处理HCC-9810细胞后放射诱导凋亡的敏感性增高,Bax mRNA和蛋白表达上调,呈NS-398剂量依赖性关系,而Bcl-2表达无明显变化,Bax/ BcL-2比值增高。结论NS-398对肝癌细胞系HCC-9810有放射增敏作用,且可能是通过上调Bax基因表达增强放射诱导凋亡作用及抑制亚致死损伤修复实现的。