新建肝癌细胞系(HCC-9810)的初步观察

目的 建立山东地区的肝癌细胞系,并研究其生物学特性.方法 将临床获取肝癌标本用组织块法进行体外培养,观察肝癌细胞的形态学、核型、增殖动力学和AFP功能.结果 肝癌细胞系(HCC-9810)具有典型的上皮细胞特征,染色体数目22～116,细胞倍增时间约20.4h.结论提示HCC-9810是一株新建肝癌细胞系,可作为进一步肝癌研究的模型.

苦丁冬青苷D对人HCC-1806乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及机制研究

目的探讨苦丁冬青苷D(KD-D)对人HCC-1806乳腺癌细胞增殖、凋亡、自噬的影响及机制。方法将人HCC-1806乳腺癌细胞作为研究对象,给予不同浓度KD-D处理后,采用CCK-8法检测细胞存活率;EdU法检测细胞增殖能力;结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力;流式细胞术(Annexin V-FITC/PI法)检测细胞凋亡;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位;免疫荧光法检测细胞Cleaved Caspase-3、LC3、P62蛋白表达;Western Blot法检测细胞Cleaved Caspase-3、Pan-AKT、Phosp-AKT、LC3Ⅱ蛋白表达;自噬双标mRFP-EGFP-LC3腺病毒感染实验检测细胞自噬流。结果与对照组比较,12.5、25、50、100、200、400μmol·L^(-1)KD-D处理HCC-1806细胞24、48 h后,随着给药浓度增大和处理时间延长,细胞活性显著降低(P<0.001),细胞内吸光度值显著降低(P<0.001),细胞增殖受到抑制;60、80μmol·L^(-1)KD-D组的细胞克隆形成计数显著减少(P<0.001);50、100、150μmol·L^(-1)KD-D组细胞的早期及晚期凋亡比例均显著升高(P<0.05,P<0.001);40、60、80μmol·L^(-1)KD-D组的红色荧光比例显著下降(P<0.001),绿色荧光比例显著升高(P<0.01,P<0.001),HCC-1806细胞线粒体膜电位下降;60、80、100μmol·L^(-1)KD-D组细胞的Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著上调(P<0.001),60μmol·L^(-1)KD-D组细胞的Pan-AKT、Phosp-AKT蛋白表达均显著上调(P<0.001);60μmol·L^(-1)KD-D组细胞的LC3蛋白荧光小点数量显著增加(P<0.001),P62蛋白平均荧光强度显著降低(P<0.001),LC3Ⅱ蛋白表达显著上调(P<0.001),自噬小体及自噬溶酶体数量显著增加(P<0.01,P<0.001),自噬流激活。与60μmol·L^(-1)KD-D组比较,KD-D+AKT抑制剂(Afuresertib)组细胞的Cleaved Caspase-3、Pan-AKT蛋白表达显著下调(P<0.01,P<0.001),Phosp-AKT蛋白表达显著上调(P<0.001)。结论KD-D能抑制人乳腺癌HCC-1806细胞增殖,并诱导其发生凋亡和自噬,KD-D诱导HCC-1806细胞凋亡可能与激活AKT信号影响Cleaved Caspase-3表达有关。

人肝癌细胞系HCC-9724的建立及其生物学特性

目的 建立一株肝癌细胞系 HCC- 972 4,为肝癌研究提供实验模型 .方法 无菌切除肝癌手术标本 ,6只裸鼠右后肢皮下包埋 ,体内连续传 3代后 ,取移植瘤体外培养 ,绘制细胞生长曲线 ,光镜、电镜观察细胞形态 ,并进行细胞周期和染色体核形分析 ,用免疫荧光法测定荷瘤鼠中 AFP的表达 .结果 移植模型原代获得率为 33.3% ,潜伏期为 5 2 d,自第 3代后肿瘤获得率为 10 0 .0 % ,潜伏期为 16 d,该模型移植瘤具有生长稳定 ,移植成功率高 (10 0 % ) ,潜伏期短 (10 d) ,无自发消退等特点 ,裸鼠移植瘤标本体外培养得到肝癌细胞系 HCC-972 4(简称 H) ,其形态结构 ,排列方式和移植瘤的分化程度与原发瘤保持一致 ,且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型 ,众数维持在 6 2～ 6 6之间 ,占 75 .0 % ,细胞周期分析 G1 期5 3.5 % ,G2 期 19.5 % ,S1 期 2 7.0 % ,细胞群体倍增时间为 2 3d,建立的裸小鼠人肝癌模型具有典型的肝细胞癌特征 ,持续分泌甲胎蛋白 (AFP) .结论 通过裸鼠体内移植瘤建立的肝癌细胞系 HCC- 972 4,与原发癌保持相同的生物学特性 ,体外连续传代 6 mo以上 ,细胞形态不变 ,生长周期恒定 。

乙醇诱导的肝癌细胞HCC-9204凋亡及其与Bax和Bcl-2蛋白的关系

目的探讨乙醇对肝癌细胞凋亡的诱导作用及其与凋亡相关基因bax和bcl-2表达的关系。方法用噻唑蓝(MTT)法检测浓度分别为20～100 mL/ L的乙醇对肝癌细胞系HCC-9204的杀伤作用。然后，用60 mL/ L乙醇作用6 h诱导HCC-9204细胞凋亡。以May-Grunwald-Giemsa (MGG)染色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞术分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化。用免疫细胞化学染色图象分析法，检测诱导凋亡前、后Bax和Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果随着乙醇浓度的增加，其对HCC-9204细胞的杀伤作用逐渐增强。60 mL/ L乙醇可使HCC-9204细胞发生明显的细胞凋亡的形态学变化，并且大部分细胞为TUNEL阳性着色。流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰。诱导凋亡后的HCC-9204细胞Bax蛋白的表达水平明显增高，而Bcl-2在诱导凋亡前、后的HCC-9204细胞中均未见表达。结论低浓度乙醇对肝癌细胞HCC-9204具有明显的凋亡诱导作用，其凋亡的发生与Bax蛋白表达水平的增高有关。

siRNA沉默MUC5AC基因对胆管癌HCCC-9810细胞生长的影响

目的探讨特异性MUC5AC-siRNA沉默MUC5AC基因后对人肝内胆管癌细胞株HCCC-9810生长能力的影响。方法设计合成三对特异性siRNA,构建了三个稳定表达质粒,pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/3,应用脂质体转染技术分别将三个稳定表达的质粒和对照质粒(空质粒对照)转染HCCC-9810,RT-PCR检测MUC5AC基因mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测MUC5AC粘蛋白的表达;MTT检测细胞生长增殖情况。结果基因测序表明成功构建质粒;转染后RT-PCR结果表明在mRNA水平,三个质粒都可抑制MUC5AC基因的表达,并可使MUC5AC的表达下降,MTT结果对细胞的生长有一定的抑制作用。结论构建pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/3质粒明显抑制了MUC5AC基因在mRNA水平及蛋白的表达,并可抑制肿瘤细胞的生长增殖,为探讨MUC5AC在MUC5AC相关肿瘤的基因治疗方面奠定了一定的理论基础。

MUC5AC特异性siRNA对胆管癌细胞株HCCC-9810增殖及凋亡的影响

目的:探讨黏蛋白5AC特异性siRNA对人肝内胆管癌细胞珠HCCC-9810体外增殖及凋亡能力的影响.方法:设计合成三对特异性siRNA,构建了三个可在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒,pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/3,应用脂质体转染技术分别将三个稳定表达的质粒和对照质粒(空质粒对照)转染HCCC-9810,应用有荧光标记的非特异性小分子的siRNA检测转染效率,RT-PCR检测黏蛋白5AC基因mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测黏蛋白5AC的表达;MTT检测细胞生长增殖情况;流式细胞仪分析细胞凋亡.结果:基因测序表明成功构建质粒;转染后荧光蛋白表达率28.57%;RT-PCR结果表明在mRNA水平,三个质粒都可抑制黏蛋白5AC基因的表达,并可使黏蛋白5AC的表达下降,MTT结果对细胞的生长有一定的抑制作用,流式细胞仪分析结果使肿瘤细胞凋亡增加.结论:构建pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/3质粒明显抑制了黏蛋白5AC基因在mRNA水平及蛋白的表达,并可抑制肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡.

肝内胆管癌细胞9810凋亡和bcl-2基因表达关系研究

应用阿霉素诱导肝内胆管癌细胞 9810凋亡 ,研究其凋亡与bcl- 2基因表达之间的关系。应用流式细胞仪检测肝内胆管癌细胞凋亡的情况 ,并同时检测bcl- 2基因表达。随着阿霉素浓度的增加 ,细胞凋亡率逐步上升 ,同时bcl- 2基因表达下调。bcl- 2基因表达下调是阿霉素诱导肝内胆管癌细胞凋亡机制之一。

人肝细胞肝癌细胞系HCC-9903生物学特性的初步观察

目的 :新建一株人肝癌细胞系 ,为肝癌研究提供新的实验模型。方法 :用组织块法培养 ,并按细胞系建立标准检测细胞的一系列生物学特性。结果 :细胞维持培养 15个月 ,传代 10 0代 ,细胞形态及超微结构具有恶性细胞的特征 ,45代细胞的倍增时间为 2 1 3h ,细胞能在软琼脂上生长 ,形成集落 ,染色体众数60～ 67条 ,主干系为亚三倍体。 1q(i) 和t(6,11)为其标记染色体 ,细胞对刀豆球蛋白有凝集反应 ,5× 10 6 细胞接种于裸鼠皮下 ,肿瘤呈进行性生长。结论 :该细胞系符合建系标准 ,是一株新建的肝癌细胞系。

乙醇诱导肝癌HCC-9204细胞凋亡的研究

目的 :探讨乙醇对肝癌细胞系HCC 92 0 4凋亡的诱导作用 ,建立乙醇诱导肝癌细胞凋亡的模型。方法 :用噻唑蓝 (MTT)法检测浓度分别为 2 %～ 10 %的乙醇对HCC 92 0 4的杀伤作用。然后用 6%乙醇作用 6h诱导HCC 92 0 4细胞凋亡。以透射电子显微镜、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)法和流式细胞术分别检测调亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化。结果 :乙醇对HCC 92 0 4细胞的杀伤作用随浓度的增加而增强。 6%乙醇可使HCC 92 0 4细胞产生明显的凋亡形态学变化 ,大部分细胞为TUNEL阳性 ,并且流式细胞仪分析可见明显的亚二倍体凋亡峰。结论 :低浓度乙醇能有效诱导HCC 92 0

circ_0005075通过海绵吸附miR-335促进肝癌HCCC9810细胞的增殖和侵袭

目的:探讨circ0005075对肝癌细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制。方法:收集唐山市工人医院2015年3月至2018年3月收治的35例肝癌患者手术切除的肝癌及其相应癌旁组织,采用qPCR检测肝癌、癌旁组织及细胞系(HCCC9810、HepG2、HLE肝癌细胞和THLE-3肝上皮细胞)中circ0005075和miR-335的表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证circ0005075、miR-335及CCND1三者间的靶向关系。采用脂质体介导方法将sh-circ0005075、miR-335 mimics、miR-335 mimics+pcDNA-CCND1、sh-circ0005075+pcDNA-CCND1、pcDNA-circ0005075+miR-335 mimics、sh-CCND1+pcDNA-circ0005075转染肝癌细胞HCCC9810,应用MTT和Transwell法检测circ0005075/miR-335/CCND1分子轴正向和回复作用对HCCC9810细胞增殖和侵袭的影响。结果:circ0005075在肝癌组织及细胞系中高表达(均P<0.01),且在HCCC9810细胞中表达水平最高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,circ0005075靶向负调控miR-335的表达水平(P<0.05),且CCND1是miR-335的靶基因(P<0.05)。正向和回复实验证明,敲降circ0005075或过表达miR-335都通过调控CCND1抑制HCCC9810细胞增殖和侵袭(P<0.05或P<0.01)。结论:circ0005075通过海绵吸附miR-335上调CCND1的表达水平,进而促进HCCC9810细胞的增殖和侵袭。

隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞中Survivin基因表达的影响

目的探讨隐丹参酮(CTS)对人胆管癌HCCC-9810细胞作用的敏感性并研究隐丹参酮对人胆管癌细胞周期及细胞凋亡率的影响,初步探讨隐丹参酮对人胆管癌细胞凋亡抑制基因Survivin表达的影响。方法体外培养胆管癌细胞HCCC-9810,采用不同浓度隐丹参酮予以干预,通过细胞形态观察及MTT实验,初步研究隐丹参酮对人胆管癌细胞HCCC-9810的敏感性;应用流式细胞仪检测隐丹参酮诱导人胆管癌细胞周期的变化;Hochest染色法检测诱导细胞凋亡;RT-PCR检测人胆管癌HCCC-9810细胞Survivin基因mRNA表达变化。结果隐丹参酮可明显抑制胆管癌HCCC-9810细胞株的增殖且该抑制效应随药物剂量的增加和作用时间的延长而增强;随着最适药物浓度作用时间的延长,胆管癌细胞明显被阻滞在G0/G1期,使S期细胞比例降低,细胞凋亡数目逐渐增加,Survivin基因mRNA表达逐渐降低。结论隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖抑制作用呈剂量和时间依赖效应;隐丹参酮能诱导人胆管癌HCCC-9810细胞凋亡,其机制可能是通过影响肿瘤细胞的细胞周期、抑制Survivin基因表达有关。

三氧化二砷诱导人胆管癌细胞系HCCC-9810凋亡的初步研究

目的 研究三氧化二砷 (As2 O3 )对胆管癌细胞的抑制作用及其机制。方法 用不同浓度的As2 O3 处理胆管癌细胞株HCCC - 9810 ,应用倒置显微镜、MTT法、流式细胞仪观察胆管癌细胞的变化。结果 As2 O3 在 0 .75、1.5、3.0、6 .0 μmol/L的浓度对胆管癌细胞作用不同时间 ,作用 72h时生长抑制率分别为 2 2 .34%、4 3.2 5 %、5 9 6 8%、6 9.95 %。结论 适合浓度的As2 O3 在体外可诱导胆管癌细胞凋亡 ,有较明显的时间和剂量依赖性 ,其发生机制可能与细胞周期阻滞有关。

荜茇酰胺对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨荜茇酰胺(PL)对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖、凋亡和生长迁移的影响。方法用MTT法检测不同浓度(0、5、20μmol/L)的PL干预后的人胆管癌HCCC-9810细胞增殖活力,并用Hochest33258试验和细胞划痕试验分别检测HCCC-9810细胞的凋亡和生长迁移情况。结果人胆管癌HCCC-9810细胞经不同浓度(0、5、20μmol/L)的PL处理后,其PL浓度越高,细胞增值率越降低(P<0.01),核变形细胞比例越高(P<0.01)。结论 PL能明显抑制人胆管癌HCCC-9810细胞的增殖,且具有明显的浓度依赖性;PL且可诱导人胆管癌HCCC-9810细胞的凋亡,并明显抑制人胆管癌HCCC-9810细胞生长迁移。

siRNA对胆管癌细胞自分泌运动因子表达的影响

目的研究针对自分泌运动因子(autotaxin,ATX)的小干扰RNA(siRNA)对人胆管癌细胞ATX基因表达的影响,探讨RNA干扰技术治疗胆管癌的前景。方法参考人黑色素瘤ENPP2基因序列,设计合成ATX-siRNA及随机阴性对照。在阳离子脂质体的介导下转染人胆管癌细胞HCCC-9810。分别于转染后24,48,72h收集细胞,用半定量RT-PCR方法检测转染后ATXmRNA表达的变化,并与对照组及ATX表达抑制剂IL-1β的作用进行比较。结果体外合成的siRNA在转染胆管癌细胞24h后ATXmRNA的表达降低,48h抑制作用最为明显,与对照组比较差异有显著性意义(P<0.01),并明显强于IL-1β(P<0.01)。结论siRNA可有效地抑制胆管癌细胞ATX的表达,从而有可能阻断ATX对肿瘤细胞运动的促进作用。

SMYD3过表达对人肝内胆管癌细胞miR-124表达及细胞增殖的影响

目的:探讨肝内胆管癌细胞HCCC-9810中SET和MYND结构域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3)过表达对miR-124表达及细胞增殖能力的影响。方法:瞬时转染SMYD3真核表达质粒后,Western blotting检测细胞中SMYD3蛋白水平的变化;qRT-PCR检测细胞中SMYD3 mRNA和miR-124表达;甲基化特异性PCR检测miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化水平;CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:以空白组为对照,肝内胆管癌细胞HCCC-9810在转染pEGFP-SMYD3质粒后,SMYD3蛋白及mRNA表达均显著上升(P<0.05),miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化显著增加(P<0.05),miR-124表达明显下降(P<0.05),细胞增殖能力显著提高(P<0.05)。结论:过表达SMYD3可引起miR-124基因启动子甲基化增加,导致胆管癌细胞中miR-124的表达下降,同时过表达SMYD3可增强细胞增殖能力。

JA_1对体外培养肝癌细胞线粒体膜电位及wt-p53基因表达的影响

为探索梯度浓度的JA1对体外培养人肝癌细胞株(HCC-9724)的细胞周期、细胞线粒体膜电位和wt-p53蛋白表达的影响.采用流式细胞技术和体外细胞培养技术,发现经JA1处理后的细胞培养样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生改变,细胞在G1被阻滞.细胞线粒体膜电位(ΔΨm)明显下降,且表现出剂量和时间效应关系.而wt-p53蛋白阳性细胞百分率则随时间延长而逐渐增加.JA1诱导了HCC-9724细胞线粒体膜电位的下降和细胞凋亡,而wt-p53蛋白表达的增强则是其诱导HCC-9724细胞凋亡的重要分子机制之一.

27-P-CAUA通过抑制HER2/PI3K/AKT信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡和线粒体自噬

目的探讨大叶冬青叶中三萜类活性成分27-P-香豆酰基-乌索酸(27-P-CAUA)对乳腺癌细胞增殖抑制的作用机制。方法27-P-CAUA处理HCC-1806细胞24、48、72 h后,CCK-8法检测HCC-1806细胞存活率;集落克隆法检测27-P-CAUA对细胞的增殖抑制作用;JC-1检测线粒体膜电位改变;流式细胞术检测细胞凋亡情况;细胞免疫荧光观察C-Caspase-3、P62表达;氯喹预处理后,Western blot观察27-P-CAUA对LC3I/II、P62以及HER2信号通路蛋白的影响。结果CCK-8和集落克隆结果显示,随着药物浓度增加和时间延长,27-P-CAUA对HCC-1806乳腺癌细胞的抑制作用逐渐增强(P<0.01),24、48、72 h的IC50值分别为83.671、49.479、19.578µmol/L;JC-1检测结果显示,线粒体膜电位改变明显(P<0.01);流式细胞术结果显示,27-P-CAUA可诱导细胞发生凋亡,细胞早期调亡比率增加3.34%;免疫荧光结果显示,C-Caspase-3表达增强,促进细胞凋亡,40µmol/L 27-P-CAUA能显著诱导细胞凋亡(P<0.01)。Western blot和细胞免疫荧光结果显示,27-P-CAUA降低LC3II表达,导致P62降解,诱导自噬发生。经氯喹预处理后,27-P-CAUA诱导自噬可被逆转。此外,27-P-CAUA可抑制细胞内Her2及AKT蛋白的磷酸化,细胞内的Her2以及磷酸化AKT蛋白表达逐渐减少(P<0.01)。结论27-P-CAUA可通过抑制HER2/PI3K/AKT信号通路,抑制HCC-1806细胞增殖,诱导细胞发生线粒体自噬和凋亡。

川陈皮素诱导人卵巢癌细胞(HO8910)的凋亡效应

目的探讨川陈皮素诱导浆液性上皮性卵巢癌细胞(HO8910)凋亡的作用及分子机制。方法采用MTT检测川陈皮素对HO8910细胞和正常卵巢上皮细胞(IOSE80)生长活力的影响,流式细胞术检测HO8910细胞凋亡率,吖啶橙染色检测HO8910细胞核的形态,JC-1染色判断川陈皮素是否通过线粒体途径诱导HO8910细胞凋亡,Western blot检测Bad、Bcl-xl、Akt、p-Akt、pro-caspase 9和pro-caspase 3蛋白的表达。结果川陈皮素选择性地影响HO8910细胞的活力;当川陈皮素浓度为80μg/mL时诱导的HO8910细胞凋亡率上升;川陈皮素浓度为80μg/mL时作用24 h细胞核发生明显聚集;川陈皮素以浓度依赖方式使细胞线粒体膜电位下降;川陈皮素上调了促凋亡蛋白Bad、pro-caspase 9和pro-caspase 3的表达,下调了抗凋亡蛋白Bcl-xl、Akt和p-Akt的表达。结论川陈皮素可通过线粒体途径,抑制PI3K/Akt信号通路激活,诱导HO8910细胞凋亡。

阿霉素诱导人肝癌细胞株HCC－9204肝癌细胞凋亡的实验研究

阿霉素诱导人肝癌细胞株ＨＣＣ－９２０４肝癌细胞凋亡的实验研究张晓东，王文亮（西安病理学教研室西安７１００３３）关键词肝细胞瘤；凋亡；阿霉素中图号Ｒ７３－３作者应用抗癌药阿霉素（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）成功地诱导培养的人肝癌细胞株ＨＣＣ－９２０４肝癌细胞...