人HCCR蛋白表达载体的构建、表达及其蛋白纯化

目的:构建人HCCR蛋白表达载体,并探讨其体外表达及表达产物的纯化。方法:培养人肝癌细胞,提取总RNA,反转录合成cDNA第一链,以此cDNA为模板经PCR合成插入片段,连接至载体pMBP-C,转化到大肠杆菌Top10F′中,进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA螯合层析进行纯化。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Westernblot和电喷雾电离串联飞行时间质谱(ESI-TOFMS)鉴定表达产物。结果:构建的表达载体经限制性内切酶酶切分析和DNA测序,证明所构建的质粒含有HCCR基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现该重组质粒经IPTG诱导后表达一种新的蛋白,这种蛋白不存在于诱导后的空载体表达产物中,表达产物经Westernblot和蛋白质谱鉴定含有HCCR蛋白的部分肽段。结论:成功构建了HCCR蛋白表达载体并进行体外表达及纯化。

大肠癌及癌旁肠黏膜组织中人子宫颈癌癌基因mRNA及蛋白的表达

目的探讨HCCR-1 mRNA及HCCR-1蛋白在人大肠癌、癌旁组织及远端正常肠黏膜组织中的表达,及其临床病理学意义。方法应用RT-PCR方法检测84例大肠癌、癌旁组织及15例远端正常肠黏膜组织中HCCR-1 mRNA水平,应用Westernblot技术检测84例大肠癌、癌旁组织及15例远端正常肠黏膜组织中HCCR-1蛋白的表达水平,应用免疫组化SP法检测84例大肠癌、癌旁组织及15例远端正常肠黏膜组织、30例管状及绒毛管状腺瘤组织中HCCR-1蛋白的表达,分析HCCR-1表达水平与大肠癌临床病理特征的相关性。结果 HCCR-1 mRNA在人大肠癌及癌旁肠黏膜组织中均有表达。HCCR-1蛋白在癌旁肠黏膜组织和管状及绒毛管状腺瘤组织的阳性率分别为38%(32/84)、30%(9/30),两者差异无统计学意义(P>0.05),在大肠癌中的阳性率为81%(68/84),明显高于癌旁肠黏膜组织和管状及绒毛管状腺瘤的阳性率(P<0.05)。大肠癌HCCR-1蛋白的高表达与肿瘤浸润深度呈明显正相关(P=0.007),与肿瘤是否转移无关(P>0.05)。结论人大肠癌存在HCCR-1蛋白的高表达,其与大肠癌的恶变演进有关。HCCR-1 mRNA的表达可能影响大肠癌的发生、发展。