人巨细胞病毒pp65蛋白的原核表达及活性鉴定

以病毒全基因组为模板,通过PCR技术扩增HCMV pp65基因编码序列,其产物连接到pMD18-T质粒,酶切并回收目的片段后克隆到表达载体pTO-T7,然后将重组质粒pTO-T7-pp65转化大肠杆菌ER2566,大量表达后将重组蛋白进行质谱法分析鉴定,再利用Western blot以及间接ELISA进行重组蛋白的活性及抗原性鉴定.结果显示:通过SDS-PAGE鉴定可知,大肠杆菌可能表达出了重组蛋白,质谱分析结果说明了重组蛋白为pp65蛋白,具有极高可信度,其相对分子质量约为63 kD,从Western blot和间接ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)的结果可知,pp65蛋白作为抗原具有良好的免疫反应性与免疫原性,为制备相应的抗原诊断单克隆抗体打下了基础,同时也为开发HCMV IgG快速诊断ELISA试剂盒提供了可选原料.

人巨细胞病毒蛋白IE1及pp65在HEL细胞中表达的时空特性

目的 研究HCMV感染HEL细胞后，病毒蛋白IE1及pp65在不同时间点的亚细胞分布及其表达量-时效变化相关性。方法 HCMV感染HEL细胞后，吸附2h，维持培养0、2、4、6、10、22及46h后，用病毒蛋白IE1的单克隆抗体及蛋白pp65的单克隆抗体做免疫细胞化学染色，检测此两种蛋白的胞内分布；同时运用图像分析系统对此检测结果进行灰度值测定，并利用方差分析分析此测定结果。结果 IE1蛋白仅在核内检测到；表达趋势是：4～6hp．i．呈表达上升趋势，6～8hp．i．又下降。pp65首先于仅在核内被检测到，之后也分布于胞浆中。pp65表达于2～8hp．i．表达增多，8～24hp．i．呈胞内稳定表达，24-48hp．i．表达降低。结论 IE1蛋白及pp65表达的亚细胞分布具有时空特异性；两种蛋白的表达量上都表现为量-时效相关性；本研究间接反映了病毒复制增殖的连续过程。