HCMV截短UL83基因真核表达重组体的构建、转染及其免疫效力研究

为了构建人巨细胞病毒（HCMV）截短UL83基因真核表达重组体，实现其在Hep-2细胞中的稳定表达，研究该截短UL83基因真核表达重组体免疫效力，采用基因重组的方法，将HCMVAD169株截短UL83基因定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上，构建真核重组表达质粒pEGFP-C1-UL83；脂质体转染至Hep-2细胞中，G418筛选获得稳定表达pp65细胞表达系。经基因测序屁示，重组体中截短UL83基因完全正确。RT-PCR和Westem blot检测证实其可在Hep-2细胞中稳定表达。用该重组体和其表达产物在HCMV先天性感染小鼠模型上进行免疫保护试验显示，母鼠血清可检测到特异性抗HCMVpp65抗体，效价为：1：2．51～1：50．79；子鼠脑组织内未分离出病毒，亦未检测出病毒pp65蛋白抗原表达。初步结果表明，pEGFP-C1-UL83具有较好的免疫原性，可作为DNA疫苗刺激机体产生有效抗体。并具有阻止病毒垂直传播的保护性作用。

HCMV在基因转染细胞中复制的研究

用人喉上皮细胞癌细胞系(HEP_2)的DNA转染人胚肺细胞(HEL),得到了5株基因转染细胞(GTC),命名为A5、B3、G8、D3和H3.这些GTC的染色体数在HEL的染色体数与两个亲代细胞(HEP-2和HEL)染色体的和数之间,感染人巨细胞病毒ADI69株后4d,D3比A5、B3、G8和H3有更多的荧光阳性细胞和更高的病毒滴度.在D3中HCMV复制随感染剂量的增大而增速.不同代数的D3对HCMV具有相似的敏感性,HCMV感染传至100代的D3,电镜证实仍可象原代D3复制大量的HCMV.永生性的D3可以用作分析调控HCMV复制的宿主细胞因子、分离培养HCMV等的工具.

D3细胞的制备及其对几种病原体的敏感性研究

目的制备基因转染(D3)细胞并测定能引起先天性感染的几种病原体的敏感性。方法HEP-2细胞的DNA转染人胚肺细胞(HEL),得到基因转染细胞,命名为D3细胞。分析D3细胞的核型。研究丹参对D3细胞促增殖作用和丹参对病原体不同的促增殖作用。普通显微镜观察病原体感染D3细胞后的细胞病变。免疫荧光试验研究D3细胞对病原体的敏感性。电子显微镜观察由D3 细胞培养物纯化的病原体形态。在酶联免疫吸附试验(ELISA)中,分别纯化病原体制作抗原,检测 1196份孕妇血清特异性抗体(IgG、IgM)。结果传代5-100代的D3细胞的染色体数均是96。丹参 (SMB,100 μg／ml)对D3细胞和病原体有明显的促增殖作用。D3细胞感染病原体后72 h,均出现明显的细胞病变效应(CPE)和荧光阳性细胞。电镜下见到了病原体典型的形态。结论永生性的D3细胞可用于培养病原体,所培养的病原体可制备用于诊断的抗原。