^(35)S标记重组人GAD_(65)抗原检测糖尿病患者GAD-Ab指数

目的 建立一种新的谷氨酸脱羧酶抗体 (GAD Ab)检测方法。方法 采用重组人GAD6 5质粒 ,经试管内转录与翻译 ,获得35S GAD6 5抗原 ,35S GAD6 5与血清在自制旋转孵育器上旋转保温 ,以蛋白质A 琼脂糖作为沉淀剂 ,用计数仪测沉淀物放射性计数 ,以GAD Ab指数 >0 .0 5作为阳性标准 ,并检测 4 3例 1型和 2 2 6例 2型糖尿病患者 ,以及 10 9例正常对照者的GAD Ab水平。结果 检测条件优化 :采用SJ15 15型35S 蛋氨酸进行试管内转录与翻译 ,自制旋转孵育器转速控制在 2 0～ 30r min ,操作环境温度为 4～ 2 5℃ ,缓冲液最佳pH值为 7.2～ 7.4 ,且新配制使用不宜超过 2周 ,以及采用水平转头离心机等。该方法批内变异系数 (CV)为 4 .9%～ 8.3% ,批间CV为 7.1%～ 10 .8% ,特异性为 98.2 % ,结果与国际标准化实验室GAD Ab检测一致率 98.3% ,Kappa值 0 .971,优于原放射配位体法。该方法检测 1型糖尿病患者阳性率为 5 8.1% (2 5 4 3例 ) ,2型糖尿病患者为 10 .2 % (2 3 2 2 6例 ) ,对照组为1.8% (2 10 9例 ) ,差异均有显著性 (P <0 .0 0 1)。结论 该方法检测GAD Ab灵敏、特异性强、重复性好 ,可望得到广泛应用。

检测pp65抗原和IgM抗体对移植患者CMV活动性感染监测价值比较

目的 比较血pp6 5抗原和IgM抗体检测对移植患者巨细胞病毒 (CMV)活动性感染的诊断价值。方法 收集 5 8位移植患者的血标本 (共 2 0 8份 ) ,分离血浆和多形核白细胞 ,血浆用于CMVIgM抗体检测 (ELISA) ,白细胞用于pp6 5抗原血症检测(荧光免疫组化 )。同时随机取部分血浆标本进行荧光定量PCR分析 ,检测CMVDNA。结果 pp6 5抗原阳性细胞数与CMVDNA拷贝数呈正相关 (r=0 .87) ,也与病人的临床症状密切相关 ,可用于监测移植患者CMV的活动性感染。IgM抗体与pp6 5抗原阳性的一致率为 2 1.2 % ,对CMV感染的敏感性为 2 2 .3% ,特异性为 95 .6 %。结论 pp6 5抗原阳性细胞数能反映CMV的数量 ,可监测CMV活动性感染 ,检测方法特异、灵敏、操作简单 ,适宜临床实验室应用。血清IgM抗体检测因为敏感性较低 ,不适用于移植患者CMV活动性感染的监测。

应用间接免疫荧光技术检测人巨细胞病毒-PP65抗原的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)-PP65抗原检测的临床意义。方法:利用间接免疫荧光技术对本院56例住院患者外周血HCMV-PP65抗原进行检测,其中器官移植组35例(肾移植患者13例,肝移植患者14例,骨髓移植患者8例),其他疾病组21例。设本院健康体检者20例为正常对照组。结果:56例标本中有25例检出HCMV-PP65抗原阳性,阳性率为45%。25例抗原阳性患者中,有临床症状的患者外周血中的HCMV-PP65抗原阳性细胞数明显高于无临床症状的HCMV-PP65抗原阳性的患者,两者比较差异有显著性(P<0.01)。正常对照组无一例阳性。结论:HCMV-PP65抗原检测具有简便、敏感的特点,其结果与患者的临床症状相关,可以作为监测HCMV活动性感染的指标,为临床提供诊治依据。

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的 建立人巨细胞病毒抗原 pp6 5 (HCMVpp6 5 )血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法 ,以利于临床推广应用。方法 以HCMV AD16 9感染的人胚肺成纤维细胞 (HELF)爬片作阳性对照 ,选择试剂和材料组建试剂盒 ,并与商品化的同类试剂盒作比较 ,建立人外周血多形核白细胞 (PMNLs)中HCMVpp6 5抗原阳性细胞的检测方法 ,然后再用荧光定量PCR(FQ PCR)方法做相应考评。 结果 我们建立的HCMVpp6 5抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的 pp6 5阳性细胞。其可检测限分别为 10 2 pfu/ml的AD16 9攻击 2 4h后的HELF细胞爬片和 3～ 5个 pp6 5阳性细胞 / 2× 10 5PMNLs ;用高相对分子质量 (5 0 0 0 0 0 )的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs ;用 4 %中性多聚甲醛固定的细胞片 ,于 - 2 0°C或以下可长期保存 (≥ 6个月 ) ,而且 pp6 5抗原性稳定。 结论 自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比 ,检测 pp6 5的结果差异无显著性 ,并与FQ PCR的检测结果相一致 ,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉 ,适宜临床实验室推广应用。

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。

人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

目的利用大肠杆菌表达系统表达截短人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白,并对其抗原性进行初步鉴定。方法采用PCR扩增HCMV pp65基因961～1 686 bp(321aa-562aa)片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)菌株,十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析蛋白表达,常规镍柱法纯化目的蛋白,以ELISA法初步检测其抗原性。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,pp65抗原和全病毒抗原的P/N值分别为2.737、2.535。结论本研究成功表达截短HCMV pp65抗原,并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。

流式细胞术检测PP65抗原血症在巨细胞病毒性肝炎诊断中的意义

目的:探讨流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测PP65抗原血症对巨细胞病毒(humancytomegalovirus,CMV)肝炎的诊断价值。方法:采用流式细胞仪对41例CMV肝炎患儿进行血PP65抗原检测,同时用PCR方法测定尿CMV-DNA并用ELISA法检测血清CMV-IgM,比较3种方法的检测结果,对部分患儿进行短期随访,分析PP65的临床应用价值。结果:41例CMV肝炎中36例检出PP65抗原阳性,阳性率达87.8%,CMV-DNA及IgM的阳性率分别为92.6%及36.6%。全身性感染伴高水平抗原血症,单纯肝炎抗原水平相对较低(P<0.01)。PP65在肝炎恢复期转为阴性或低水平,病情恶化时明显增高。结论:PP65抗原血症检测是诊断活动性CMV感染的有效手段,量化结果有助于监测病情。

结核杆菌抗原HSP65基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :为研制预防结核病疫苗 ,选取结核杆菌HSP65蛋白为免疫抗原 ,将结核分枝杆菌HSP65抗原基因在大肠杆菌中表达、纯化。方法 :将HSP65的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX5T中 ,构建成pGEX5T HSP65重组质粒。将质粒转化到E .coli.K80 2细菌 ,用IPTG诱导HSP65表达 ,然后用亲和层析的方法进行纯化 ,最后用Western blot方法确认表达蛋白的特异性。结果 :获得了pGEX5T HSP65重组子 ,HSP65蛋白在k80 2菌中获得了表达 ,表达的蛋白条带大小约 86kDa ,与预期的结果相符。表达产物经亲和层析后获得了较单一的蛋白条带 ;表达及纯化的蛋白在纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别。为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础。

荧光定量PCR和外周血白细胞pp65抗原血症实验对肾移植术后巨细胞病毒感染的检测

目的 探讨肾移植术后 3个月巨细胞病毒 (CMV)的感染状况 ,比较荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验两种方法对肾移植术后巨细胞病毒感染的检测情况和使用价值。方法 分别用荧光定量PCR、外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验和ELISA法对我院 2 0 0 1年 1月～2 0 0 2年 12月 5 6例肾移植患肾移植术后 3个月的外周血进行巨细胞病毒的检测。结果 5 6例肾移植患者中CMVpp5 6抗原血症阳性 9例 ( 16 1% ) ,PCR阳性 11例 ( 19 6 % ) ,12例 ( 2 1 4 % )诊断为CMV感染 ,其中 7例为症状性感染 ,5例为无症状性感染。荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验的一致性为 92 % ,阳性符合率 6 7% ,阴性符合率 92 %。CMVpp6 5抗原、CMVDNAPCR、CMV IgM的敏感性、特异性分别为 72 %、92 % ;10 0 %、92 % ;4 3%、88%。结论 荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验的联合应用 ,对监测CMV活动性感染、临床疗效及预后更加客观。

急性脱髓鞘脑病患者人巨细胞病毒pp65抗原血症检测的临床意义

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)在急性脱髓鞘脑病(ADBD)中的病原学作用,并评估HCMV-pp65抗原血症在ADBD活动性HCMV感染早期诊断、抗病毒治疗及疗效判断中的价值。方法采用HCMV单克隆抗体免疫荧光法,对64例ADBD患者的外周血进行HCMV-pp65抗原检测,同时采用金标免疫斑点法检测血清HCMV-IgM,并对检测结果以及抗病毒药物应用与疗效进行分析。结果64例ADBD中HCMV-pp65阳性17例(26.6%),HCMV-IgM阳性8例(12.5%);HCMV-pp65阳性者,应用膦甲酸钠治疗9例,痊愈6例(66.7%),好转3例(33.3%);应用无环鸟苷治疗8例,痊愈2例(25.0%),好转4例(50.0%),无效2例(25.0%)。结论HCMV与ADBD的发生密切相关,HCMV-pp65抗原检测是一种敏感性、特异性强的方法,有助于HCMV感染疾病的早期诊断,指导抗病毒治疗及疗效的评价;膦甲酸钠对HCMV感染所致ADBD效果良好。

HCMVpp65抗原和IgM抗体检测诊断儿童HCMV活动性感染的比较

目的:比较人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原(以下简称pp65)检测和血清HCMV-IgM抗体(以下简称IgM抗体)检测两种方法对儿童HCMV活动性感染的诊断实用意义。方法:采集临床疑似HCMV活动性感染儿童血标本(共251份),分离血浆和多形核白细胞,分别用于IgM抗体检测和pp65检测。同时进行荧光定量PCR检测HCMVDNA,与pp65抗原作平行比较。结果:pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为73.3%。与HCMVDNA检测相比pp65抗原检测法的符合率、特异度和敏感度分别为85.5%,85.2%和86.2%。而且高pp65抗原血症与患者的临床症状密切相关。结论:pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染。由于儿童患者还存在原发感染的可能性,所以,联合HCMV-IgM的监测来提高临床的诊断率。

流式细胞技术检测肾脏移植受者pp65抗原血症的意义

背景:临床对pp65 抗原的检测主要采用免疫荧光技术,但是该方法步骤繁琐,需要对标本进行人工计数,在检测过程中受人为的影响因素较多。目的:探讨使用简便的流式细胞技术检测人巨细胞病毒 pp65 抗原血症的可行性及其特点。设计、时间及地点:对比观察实验,于2007-09/2008-03 在解放军总医院附属二院器官移植中心完成。材料:肾脏移植受者外周血标本145份。方法:分离人外周血白细胞,分别采用免疫荧光技术与流式细胞技术对人巨细胞病毒 pp65 抗原检测。主要观察指标:流式细胞仪在激发波长为 488 nm 处的吸收峰判断阳性检出。结果:对肾脏移植受者进行免疫荧光技术检测,在 15 例受者的 25 份标本中检出阳性,检出的特异性为 76.0%;对肾脏移植受者进行流式细胞技术检测,在 5 例受者的 11 份标本中检出阳性,检出的特异性为 54.5%。使用 Fisher 确切概率法对两种不同检测方法检出的效果进行检验,结果两种检测方法的检出效果差异无显著性意义(P > 0.05)。结论:免疫荧光技术和流式细胞技术两种 pp65 抗原检测方法的检出效果无差异,因此可以通过流式细胞技术对 pp65 抗原进行检测,并且结果更加客观。

间接免疫荧光法检测冠心病患者外周血单个核细胞PP65抗原

目的:了解冠心病患者外周血单个核细胞巨细胞病毒活动感染情况,并探讨动脉粥样硬化与HCMV感染的关系。方法:运用间接免疫荧光的方法,对29例冠心病患者、39例其他心血管病患者以及42例正常对照组外周血单个核细胞巨细胞病毒PP65抗原进行检测,并运用免疫散射比浊法对各组CRP进行测定。结果:29例冠心病患者中巨细胞病毒pp65抗原阳性者7例,占24.1%;与其他心血管患者中巨细胞病毒pp65抗原阳性率(5.1%)以及正常对照组巨细胞病毒pp65抗原阳性率(2.4%)相比明显升高,29例冠心病患者CRP水平(5.06±1.79mg/L)也明显高于其它两组(P<0.05)。结论:冠心病患者外周血单个核细胞巨细胞病毒活动感染可能在动脉粥样硬化的发展过程中有重要作用。

外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义

目的明确人巨细胞病毒(HCMV)磷酸基质蛋白65(pp65)抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系,为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据。方法利用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点,在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位;同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术,检测分析其定位与病毒活动的关系。结果临床标本检测的HCM- Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种,即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型,其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部,而非仅仅附着于核表面。进一步的白细胞与病毒共培养结果显示,只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)与外周血白细胞共培养,才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞,而且表现为仅初期(培养1 h内)可检出细胞浆阳染型,随着时间延长,约80%～90%的抗原阳染白细胞表现为细胞核型,偶见细胞浆核混合型。结论HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种,即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型,其中细胞核型属细胞核内部型,并非细胞核表面附着型。结合共培养结果认为,细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动。

流式细胞术分析HCMV—PP65抗原在外周血各有核细胞群上的表达及意义

目的研究分析人外周血有核细胞感染人类巨细胞病毒PP65抗原（Human Cytomegalovirus PP65 antigen，HCMV—PP65Ag）的阳性表达率及临床意义。方法应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）对广州军区广州总医院2007年1月～2008年12月共256例患者的外周血有核细胞HCMV—PP65Ag阳性表达百分率进行分析，其中移植组80例，肿瘤组48例，肾功能不全组86例，其它疾病组42例；设门诊健康体检者20例为正常对照组。对HCMV检出阳性患者根据并发细菌感染与否分为两组，观察两组间临床治疗方案的选择。另对26例HCMV现症感染患者进行连续四周检测，动态观察HCMV—PP65Ag的表达与临床症状的关联。结果256例患者共检出144例HCMV—PP65Ag阳性；HCMV-PP65Ag阳性患者中并发细菌感染与无细菌并发感染两组临床发热娃状及临床用药方案间比较差异均有统计学显著性意义（均P〈0．05）。动态观察组监测结果显示，持续HCMV—PP65Ag检测阳性患者，尤其是粒细胞群表达阳性时，临床多表现有发热症状及易并发细菌感染。结论运用FCM检测人外周血有核细胞表面HCMV—PP65Ag，能快速、准确、有效地提供HCMV感染依据；而对HCMV感染的各细胞群进行分析，有利于临床了解疾病情况和制订治疗方案。

卵巢上皮性肿瘤组织中黏蛋白抗原4和核因子-κB/p65蛋白表达及临床意义

目的探讨黏蛋白抗原4(MUC4)及核因子(NF-κB/p65)在卵巢癌组织中的表达及临床意义。方法通过免疫组化方法,用MUC4及NF-κB/p65抗原检测正常卵巢组织和卵巢上皮性肿瘤组织中MUC4、NF-Kb/p65的表达,分析其临床意义。结果在卵巢癌中MUC4、NF-Kb/p65蛋白的阳性表达率分别为80%、92.30%,与卵巢交界性、良性及正常卵巢组织两两相比,差异均有统计学意义,且MUC4和NF-Kb/p65阳性表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05)。结论 MUC4和NF-κB/p65蛋白表达与卵巢癌分化程度、淋巴结转移关系密切,MUC4可望作为卵巢癌早期诊断的标志物,黏附分子的表达可能受核转录因子的调控。

河北省部分地区40岁以上普通人群HCMV-pp65阳性率的调查分析

目的了解河北省普通人群中人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染的现状,进而探讨动脉粥样硬化的病毒病因学说。方法选取河北省9个地区(石家庄、保定、沧州、邢台、邯郸、廊坊、衡水、张家口、承德)的普通人群,年龄在40岁以上(包括40岁)共3153例,其中农村人群组2699例,城镇人群组454例,抽取外周血采用免疫组织化学方法进行人巨细胞病毒膜磷脂蛋白抗原65(HCMV-pp65)检测。结果河北省部分普通人群中HCMV-pp65阳性率为16.24%,其在性别间无差异,在年龄及城乡分布间有统计学差异,随年龄增长而增高,农村人群高于城镇人群;农村人群组及城镇人群组HCMV-pp65阳性率分别为16.86%、12.56%,其均在性别间无差异,随年龄增长而增高。结论河北省普通人群中存在人巨细胞病毒的激活感染,初步统计HCMV-pp65阳性率为16.24%,HCMV-pp65阳性率在性别间无差异,而存在年龄及城乡分布的差异。

HCMV（pp65）抗原血症-肝、肾移植术后巨细胞病毒感染监测的分析

目的通过5000次肝、肾移植术后病人外周血HCMV（pp65）抗原血症检测结果与用ELISA方法检测HCMV特异性IgM、IgG抗体的检测结果进行比较和观察，探讨各种检测方法在检测器官移植术后HCMV感染中的作用。方法应用间接免疫荧光方法，检测2002年1月至2004年11月在我院接受肝、肾移植手术后病人外周血白细胞内人巨细胞病毒（HCMV）的基质磷蛋白（pp65）共检测血标本5000次，阳性病人应用ELISA方法检测HCMV特异性IgM抗体。结果5000次HCMV（PP65）抗原血症检测中，阳性1053次，占21．06％；1053次HCMV（PP65）抗原血症阳性病人，ELISA方法检测HCMV特异性IgM抗体，103次出现阳性。1053次HCMV（PP65）抗原血症阳性病人中约85．23％出现HCMV感染的症状及HCMV病。结论HCMV（PP65）抗原血症检测与其它检测HCMV方法相比，可以早期、快速、准确的检测出肝、肾移植术后病人巨细胞病毒感染，为临床抗病毒治疗提供依据，使HCMV病的发生率明显降低。

HCMV PP65抗原核酸适配子的筛选及活性鉴定

目的以人巨细胞病毒HCMV PP65抗原为靶分子,筛选与其有高亲和力、高特异性的适配子。方法采用SELEX技术筛选HCMV PP65抗原特异的适配子,进行亲和性检测以及二级结构预测,以筛选获得的最优序列作为捕获适配子,建立基于"磁珠-适配子-抗原-荧光单克隆抗体"的夹心检测方法,实现对PP65抗原的初步检测。结果本实验经过8轮筛选获得6条与靶物质高亲和性,高特异性结合的适配子。结论适配子的成功筛选,为建立基于适配子检测HCMV PP65抗原的新方法奠定了基础。