穿梭质粒pCDH1-GFP-HCN 4的构建及HCN 4重组慢病毒的包装

目的将全长约3.6 kb的HCN 4目的基因片段从pCDNA3-HCN 4质粒卸载下来,建立稳定的HCN 4重组慢病毒。方法用Eco RⅠ和XbaⅠ从pCDNA3-HCN 4质粒切下HCN 4目的片段连接到Puc19载体中,再用EcoRⅠ和HindⅢ从质粒Puc19切下目的片段并连接到pcDNA3.1(A)载体中,再用XbaⅠ单酶从质粒pcDNA3.1(A)双切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中。用XbaⅠ或者Eco RⅠ鉴定,将阳性克隆质粒送上海生工测序,慢病毒的包装参照SBI的Lentivector Expression System操作手册进行。将构建好的慢病毒包装质粒混合物混合后感染293T细胞及心肌样骨髓基质干细胞。结果 (1)XbaⅠ及Eco RⅠ鉴定表明,PCR产物和克隆扩增产物的电泳结果显示该基因的大小约为3.6 kb;阳性克隆质粒测序结果与GENEBANK目的基因HCN 4序列完全相同;构建的目的基因质粒转染293细胞和原代猪骨髓间充质干细胞后,均发现有强烈的绿色荧光出现。(2)构建的慢病毒包装质粒混合物转染293细胞后,发现有强烈的绿色荧光出现,细胞感染率达90%以上。结论 (1)成功将全长HCN 4目的基因片段从pCDNA3-HCN 4质粒卸载下来,成功构建穿梭质粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP。(2)成功建立稳定的HCN 4重组慢病毒,该病毒载体有很高的转染效率。