姜黄素逆转结肠癌HCT-116/5FU细胞耐药作用机制研究

目的探讨姜黄素逆转人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5FU耐药的作用机制。方法姜黄素、5-FU诱导耐药细胞HCT-116/5FU凋亡,按对照组、5-FU组、姜黄素组及联合用药组分为四组,对照组予普通培养基;5-FU组予含5-FU 200μM培养基;姜黄素组予姜黄素20μM培养基;联合用药组予含5-FU 200μM和姜黄素20μM培养基。采用MTT法检测细胞增殖以明确最佳实验条件;AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡率;Western blot检测亲本株及耐药细胞株内cleaved-Caspase3、IL-6、STAT3蛋白表达水平。结果姜黄素联合5-FU干预人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5FU后细胞增殖受明显抑制;联合用药组HCT-116/5FU细胞凋亡率为(56.0±12.1)%,明显高于5-FU组(6.5±3.2)%和姜黄素组(19.9±7.2)%(P<0.05);耐药细胞株IL-6、STAT3蛋白表达明显高于亲本株;姜黄素降低耐药细胞株IL-6、STAT3的蛋白表达量,诱导cleaved-Casepase 3蛋白表达。结论姜黄素能逆转人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5FU耐药,其机制可能与下调IL-6/STAT3有关。

Runt相关转录因子3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性

目的建立耐5-氟尿嘧啶(5-FU)的人结肠癌细胞株HCT-116/5-FU,初步探讨Runt相关转录因子3(RUNX3)与结直肠癌耐药的关系。方法采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法建立人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,CCK-8法检测5-FU对亲本株HCT-116及耐药株HCT-116/5-FU的半数抑制浓度(IC_(50)值),绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间(TD);qRT-PCR和Western blot法检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药蛋白(LRP)的mRNA和蛋白表达。采用siRNA技术敲低HCT-116细胞中RUNX3的表达,分为RUNX3敲低组(si-RUNX3-1组、si-RUNX3-2组)和阴性对照组(si-NC组),qRT-PCR和Western blot法分别在mRNA水平和蛋白水平验证RUNX3的敲低效率;CCK-8法测定si-RUNX3组和si-NC组的IC_(50)值,Western blot法测定两组中P-gp、MRP1和LRP的表达情况。结果成功构建稳定的人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,耐药倍数为7.7倍;HCT-116/5-FU耐药细胞株群体TD较HCT-116亲本株明显延长(P<0.001),耐药细胞群体TD是亲本细胞的1.38倍(P=0.002),耐药株细胞形态发生变化。耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3 mRNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显降低(P=0.048),P-gp(P=0.008)、MRP1(P=0.001)和LRP mRNA(P=0.001)表达水平较亲本细胞株HCT-116明显升高;耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3蛋白质相对表达量较亲本细胞株HCT-116明显降低(P<0.001),P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较亲本细胞株明显升高(P均<0.001)。成功构建了RUNX3低表达的HCT-116细胞模型,si-RUNX3-1组RUNX3 mRNA的表达与si-NC组相比差异无统计学意义(P=0.064),si-RUNX3-2组明显低于si-NC组(P=0.034);si-RUNX3-1组和si-RUNX3-2组RUNX3蛋白的表达量均明显低于si-NC组(P均<0.001),si-RUNX3-2组的敲低效率更高。选用si-RUNX3-2组完成后续实验,si-RUNX3组的IC_(50)值较si-NC组明显升高,下调RUNX3的表达能明显降低HCT-116细胞对5-FU的敏感性(P<0.001);si-RUNX3组的P-gp、MRP1和LRP蛋白相对表达量均明显高于si-NC组(P均<0.001)。结论RUNX3表达下调能降低人结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性,可能与RUNX3表达的降低上调P-gp、MRP1和LRP等耐药蛋白表达,从而增加细胞的耐药性有关。

姜黄素与5FU对人结肠癌HCT-8细胞及HCT-8/5FU细胞凋亡的影响

目的通过姜黄素与5FU的干预,研究观察其对HCT-8敏感株及HCT-8/5FU耐药株细胞凋亡的影响。方法用CCK-8法测定姜黄素与5FU对HCT-8敏感株及HCT-8/5FU耐药株细胞的生长抑制率;用流式细胞技术检测细胞的凋亡。结果在姜黄素与5FU的干预下,促进了HCT-8敏感株及耐药株细胞的凋亡,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论姜黄素与5FU能诱导体外培养的HCT-8敏感株及HCT-8/5FU耐药株细胞凋亡,两种药物联合使用,相比单纯姜黄素诱导细胞凋亡程度更高,考虑在治疗作用方面,两者具有明显的协同作用。

姜黄素增强结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性及其机制研究

目的探究姜黄素(CUR)增强结肠癌HCT-116细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性及其机制。方法首先检测CUR和5-FU单用及联用对体外培养的HCT-116细胞增殖能力的影响,并分析两药联用的协同效应;然后分别检测CUR增强5-FU对HCT-116细胞迁移的抑制效应和凋亡的诱导效应;最后检测NF-κB、caspase-3、E-cadherin的表达水平。结果CUR单用、较大剂量5-FU单用和CUR与低剂量5-FU联用对HCT-116细胞增殖均有抑制作用(P<0.05),并且呈现时间和剂量依赖效应;两药可呈协同效应;各药物组均显著抑制HCT-116细胞发生转移;诱导凋亡(P<0.01);WB结果显示,两药联合处理后,NF-κB表达水平显著降低,而凋亡蛋白caspase-3与E-cadherin表达显著增高。此外,各实验中联用组的抑制效应显著高于各单用组(P<0.05)。结论姜黄素可通过NF-κB信号通路,诱导凋亡、抑制EMT,增强结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性。

长链非编码RNA KCNQ1OT1靶向调控miR-218-5p对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA KCNQ1重叠转录物1(lncRNA KCNQ1OT1)调控micro RNA-218-5p(miR-218-5p)对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响及其可能机制。方法:收集2019年1月至4月在宜昌市第一人民医院行根治性结肠癌切除术的30例肿瘤组织和相应的癌旁正常组织。采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测lncRNA KCNQ1OT1,miR-218-5p在结肠癌组织、癌旁正常组织、5种结直肠癌细胞系(HCT-116,SW480,SW620,DLD-1,HT29)及正常结肠上皮细胞系CCD841中的表达水平;干预结肠癌细胞系HCT-116和SW480中lncRNA KCNQ1OT1和miR-218-5p的表达,采用CCK-8法检测结肠癌细胞的增殖,Transwell法检测结肠癌细胞的迁移和侵袭;采用流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡率;用Starbase数据库预测lncRNA KCNQ1OT1的靶向miRNA,并用qRT-PCR、双荧光素酶报告基因法验证lncRNA KCNQ1OT1与miR-218-5p的靶向关系。结果:与癌旁正常组织和正常结肠上皮细胞系相比,结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中lncRNA KCNQ1OT1的表达水平显著上调,miR-218-5p的表达显著下调(P<0.05);过表达lncRNA KCNQ1OT1促进SW480细胞的增殖、迁移和侵袭,且减少处于G0/G1期的细胞比率,抑制细胞凋亡;在结直肠癌组织中lncRNA KCNQ1OT1的表达水平与miR-218-5p的表达水平呈负相关(r^2=0.437,P<0.001);双荧光素酶报告基因法分析证实lncRNA KCNQ1OT1能特异性结合miR-218-5p,并能降低其表达;过表达miR-218-5p抑制HCT-116细胞的增殖、迁移和侵袭,增加处于G0/G1期的细胞比率,促进细胞凋亡,且miR-218-5p的表达可以抑制由lncRNA KCNQ1OT1过表达引起的细胞增殖、迁移和侵袭能力的增加及凋亡的减少。结论:LncRNA KCNQ1OT1通过靶向调控miR-218-5p表达影响结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进结直肠癌的发展。

lncRNA KCNQ1OT1在结肠癌细胞中的促癌功能和下游调控通路研究

目的明确lncRNA KCNQ1OT1在结肠癌HCT-116和HT-29细胞中的功能,探讨其作用的分子机制。方法在结肠癌HCT-116和HT-29细胞系中转染KCNQ1OT1的过表达质粒及空白对照,siRNA干扰KCNQ1OT1及空白对照;分别在两个细胞系中进行CCK8、划痕实验、Transwell、细胞侵袭实验以验证KCNQ1OT1对细胞功能的影响;免疫共沉淀(RNA immune precipitation,RIP)和双荧光素酶标记实验分别验证KCNQ1OT1与miR-125a-5p的特异结合以及miR-125a-5p和SMURF1蛋白的特异结合。过表达和敲低KCNQ1OT1、miR-125a-5p后,Western hlot验证SMURF1的表达;完成过表达KCNQ1OT1同时过表达miR-125a-5p、敲低KCNQ1OT1同时敲低miR-125a-5p后检测SMURF1表达情况的Resecue实验,验证KCNQ1OT1与miR-125a-5p的调控关系。结果在结肠癌HCT-116和HT-29细胞中,过表达的KCNQ1OT1能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭;KCNQ1OT1敲低后,结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭受抑制;miR-125a-5p与KCNQ1OT1及SMURF1均能特异性结合;过表达KCNQ1OT1促进SMURF1的表达,敲低KCNQ1OT1抑制SMURF1的表达;过表达miR-125a-5p抑制SMURF1的表达,敲低miR-125a-5p促进SMURF1的表达;过表达KCNQ1OT1的基础上同时表达miR-125a-5p能显著抑制SMURF1的表达,敲低KCNQ1OT1的基础上同时敲低miR-125a-5p能促进SMURF1的表达。结论在结肠癌细胞中,lncRNA KCNQ1OT1通过KCNQ1OT1-miR-125a-5p-SMURF1调控轴,促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

5-氟尿嘧啶纳米药膜的体外缓释及其对结肠癌细胞抑制作用研究

目的研究担载抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-FU)的左旋聚乳酸(PLLA)共混羊毛蛋白纳米纤维药膜的缓释功能及其对结肠癌细胞的体外抑制效果。方法将PLLA与羊毛蛋白共混交联,并加入抗肿瘤药物5-FU,利用高压静电纺丝技术将共混溶液制作成具有缓释效果的纳米纤维薄膜。通过扫描电镜(SEM)观察其形貌。以高效液相色谱法(HPLC)测定5-FU/PLLA羊毛蛋白药膜中5-FU的缓释效果。采用噻唑蓝(MTT)比色法,检测药膜对结肠癌细胞HCT116的体外杀伤效果。同时采用倒置相差显微镜、透射电子显微镜(TEM)观测实验组细胞的生长情况。结果由SEM可以看出5-FU能够均匀分布在纳米纤维药膜中,HPLC显示5-FU能够缓慢释放并基本符合零级动力学规律。采用不同处理因素后,通过显微镜观察,药膜浸泡时间越长的实验组细胞出现肿胀、凋亡、坏死的情况越明显。MTT检测纳米药膜实验组的细胞存活率为(47.5±2.8)%,而不含药物的纯膜组对细胞基本无影响,其存活率为(93.9±2.8)%,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 5-FU/PLLA羊毛蛋白纳米药膜有明显缓释效果,具有较好的肿瘤细胞抑制作用和潜在的医疗应用价值。

一种新型奥沙利铂衍生物5a的抗肿瘤活性研究及其机制探索

铂类配合物5a是从200多个新合成的铂类配合物中筛选得到。该文旨在研究其对多种肿瘤细胞的体外抗肿瘤作用,对正常细胞的毒性,同时对其抗肿瘤作用机制进行初步探讨。采用CCK8试剂盒检测5a对不同来源的肿瘤细胞的抑制作用。用透射电子显微镜观察5a作用后人结肠癌细胞HCT-116形态的变化。采用流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内活性氧水平的变化,并通过Western blot检测相关凋亡蛋白表达。结果显示5a可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,呈剂量依赖性。透射电镜和流式细胞术检测结果表明,5a能诱导HCT-116发生凋亡,并使细胞内活性氧水平显著提高。5a作用后的HCT-116细胞呈现典型凋亡特征,并促使细胞色素C从线粒体释放到胞浆内,从而激活Caspase-9。总之,配合物5a在体外显示了良好的抗肿瘤活性,有成为一种新一代铂类抗癌药物的潜能,并能诱导HCT-116细胞发生内源性凋亡。