穿琥宁对大肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞株逆转作用的研究

目的:探讨中药制剂穿琥宁对HCT-8/5-FU多药耐药细胞株的影响。方法:观察0.4,1.2和2.4mg·mL-1穿琥宁作用下的HCT-8/5-FU多药耐药细胞株生长曲线,MTT法检测上述浓度下的细胞抑制率。MTT法、流式细胞仪PI染色法检测穿琥宁与化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(DDP)和阿霉素(ADM)联合作用下,对HCT-8-5-FU耐药细胞的毒性作用和凋亡率。流式细胞仪罗丹明染色法和PI染色法探讨穿琥宁的作用机制。结果:0.4mg·mL-1穿琥宁生长曲线与正常对照组无明显差别,1.2mg·mL-1穿琥宁对细胞生长有轻度抑制作用,2.4mg·mL-1浓度有一定抑制,但细胞仍可生长。MTT法检测0.4,1.2,2.4mg·mL-1穿琥宁作用下,HCT-8/5-FU耐药细胞株的抑制率分别为7.2%,13.2%,21%。1.2mg·mL-1穿琥宁与5-FU,DDP,AMD联合作用,与这3种化疗药物单独作用比较细胞凋亡率分别为54.2%/26.4%;42.6%/13.6%;30.8%/14.2%,差异显著(P<0.01)。罗丹明染色法提示穿琥宁的作用机制可能与影响P-170的活性有关。但穿琥宁本身并不诱导凋亡,对细胞周期也无影响。结论:低浓度穿琥宁对HCT-8/5-FU细胞无明显抑制作用;与5-FU,ADM,DDP联合作用,可增加上述化疗药物的毒性作用,使肿瘤细胞的凋亡率增高,其机制可能与抑制P-170功能有关。

Runt相关转录因子3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性

目的建立耐5-氟尿嘧啶(5-FU)的人结肠癌细胞株HCT-116/5-FU,初步探讨Runt相关转录因子3(RUNX3)与结直肠癌耐药的关系。方法采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法建立人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,CCK-8法检测5-FU对亲本株HCT-116及耐药株HCT-116/5-FU的半数抑制浓度(IC_(50)值),绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间(TD);qRT-PCR和Western blot法检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和肺耐药蛋白(LRP)的mRNA和蛋白表达。采用siRNA技术敲低HCT-116细胞中RUNX3的表达,分为RUNX3敲低组(si-RUNX3-1组、si-RUNX3-2组)和阴性对照组(si-NC组),qRT-PCR和Western blot法分别在mRNA水平和蛋白水平验证RUNX3的敲低效率;CCK-8法测定si-RUNX3组和si-NC组的IC_(50)值,Western blot法测定两组中P-gp、MRP1和LRP的表达情况。结果成功构建稳定的人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,耐药倍数为7.7倍;HCT-116/5-FU耐药细胞株群体TD较HCT-116亲本株明显延长(P<0.001),耐药细胞群体TD是亲本细胞的1.38倍(P=0.002),耐药株细胞形态发生变化。耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3 mRNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显降低(P=0.048),P-gp(P=0.008)、MRP1(P=0.001)和LRP mRNA(P=0.001)表达水平较亲本细胞株HCT-116明显升高;耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3蛋白质相对表达量较亲本细胞株HCT-116明显降低(P<0.001),P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较亲本细胞株明显升高(P均<0.001)。成功构建了RUNX3低表达的HCT-116细胞模型,si-RUNX3-1组RUNX3 mRNA的表达与si-NC组相比差异无统计学意义(P=0.064),si-RUNX3-2组明显低于si-NC组(P=0.034);si-RUNX3-1组和si-RUNX3-2组RUNX3蛋白的表达量均明显低于si-NC组(P均<0.001),si-RUNX3-2组的敲低效率更高。选用si-RUNX3-2组完成后续实验,si-RUNX3组的IC_(50)值较si-NC组明显升高,下调RUNX3的表达能明显降低HCT-116细胞对5-FU的敏感性(P<0.001);si-RUNX3组的P-gp、MRP1和LRP蛋白相对表达量均明显高于si-NC组(P均<0.001)。结论RUNX3表达下调能降低人结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性,可能与RUNX3表达的降低上调P-gp、MRP1和LRP等耐药蛋白表达,从而增加细胞的耐药性有关。

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-Fu中microRNA表达的初步研究

目的建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关的microRNA。方法采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线;用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用microRNA芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中mi-croRNA的表达谱,筛选差异表达的microRNA;用实时荧光定量PCR方法对筛选出的部分差异microRNA在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证。结果 LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大,耐药株LoVo/5-FU细胞相对于其亲本LoVo细胞的耐药倍数为8.08。microRNA芯片的结果显示,耐药株LoVo/5-FU细胞与亲本LoVo细胞比较,有10个microRNA表达上调,13个microRNA表达下调;实时荧光定量pcr的结果进一步证实mir-210、mir196a、mir-1281在LoVo/5-FU中显著上调,而let-7f、mir-1228显著下调,其中mir-210在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异。结论 LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,筛选获得的差异miRNA可能通过调控其靶基因而参与人结肠癌细胞对5-Fu的耐药,为进一步研究microRNA在结肠癌耐药机制中的作用奠定基础。

结肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立及其差异表达基因的筛选

目的:建立结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU并初步筛选可能的耐药相关基因.方法:采用5-FU浓度递增法建立人结肠癌细胞耐药模型LoVo/5-FU,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线:用MTT法鉴定耐药细胞株耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株LoVo/5-FU与其亲本细胞株LoVo中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR方法对筛选出的部分耐药相关基因在耐药细胞及其亲本细胞中的表达情况进行验证.结果:LoVo/5-FU细胞与LoVo细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大.LoVo/5-FU对5-FU、ADM、MMC耐药,而对CDDP无耐药性(RI:7.69,2.78,1.43和0.96).通过基因芯片筛选出差异表达基因425个,可能的耐药相关基因包括CYP1B1,NAT2,RNF20,SNAI2,MAP3K2,其中CYP1B1在LoVo/5-FU与LoVo中的表达有明显差异(Cy5/Cv3=5.877).结论:LoVo/5-FU细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与CYP1B1,NAT2等耐药相关基因有关.

PARP1通过调控N-糖基转移酶FUT8影响胃癌AGS细胞的增殖与5-FU耐药

目的:探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP1)对胃癌AGS细胞的增殖和5-FU耐药性的影响及其可能的机制。方法:收集2018年5月至2019年12月于恩施土家族苗族自治州中心医院就诊的72例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织,采用qPCR和免疫组化法检测胃癌和癌旁组织中PARP1的表达状况。CCK-8法、流式细胞术和集落形成实验分别检测PARP1抑制剂AG14361对胃癌AGS细胞增殖、凋亡和集落形成的影响,MTT法检测AG14361对胃癌细胞5-FU敏感性的影响。mRNA测序分析AG14361处理AGS细胞后差异基因整体分布情况,KEGG富集分析相关信号通路。向AGS细胞转染siFUT8以敲减FUT8基因的表达,qPCR和WB法检测AGS细胞内α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的表达状况和敲减FUT8效果,CCK-8法、流式细胞术和集落形成实验分别检测AG14361处理对敲减FUT8表达的AGS细胞增殖、凋亡和集落形成的影响。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中PARP1呈高表达(P<0.001)。AG14361处理可显著抑制AGS细胞的增殖和细胞集落形成,促进AGS细胞凋亡(均P<0.01)。AG14361处理可降低5-FU杀伤胃癌细胞的IC_(50),且在AGS细胞中尤为明显,IC50下降超过60%。m RNA测序结果显示,N-糖基化修饰中FUT8是AG14361抑制AGS细胞增殖的关键糖基转移酶(P<0.05)。与siNC组相比,IC_(50)浓度的AG14361可显著逆转干扰FUT8对AGS细胞增殖的增加,促进细胞凋亡和BAX蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达,抑制FUT8干扰所致AGS细胞集落的增加(均P<0.01)。结论:PARP1可通过调控N-糖基转移酶FUT8促进胃癌细胞恶性转化,其抑制剂AG14361可增强胃癌细胞对5-FU的敏感性,PARP1可能成为胃癌治疗的一个潜在靶标。

人喉癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株的建立及其生物学特性

目的:建立人喉癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)耐药细胞系,为喉癌的耐药机制研究提供模型。方法:以高剂量浓度递增间歇给药的方法诱导筛选人喉癌Hep-2的多药耐药细胞株Hep-2/5-FU,比较两组细胞的形态和倍增时间;MTT法确定细胞的IC50及其耐药指数;流式细胞仪检测两组细胞的细胞周期分布以及细胞内的罗丹明聚集;实时定量PCR法检测MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测相应MDR1-P蛋白的表达。结果:建成性能稳定的Hep-2/5-FU耐药细胞株,并与顺铂及长春新碱有不同程度的交叉耐药性,且Hep-2/5-FU细胞倍增时间较Hep-2细胞延长[(31.25±4.37)h vs(25.62±3.53)h,P<0.05]。Hep-2/5-FU细胞G0/G1期比例升高[(45.6±3.4)%vs(30.5±1.2)%,P<0.05],而S期比例明显降低[(32.1±4.2)%vs(52.4±3.6)%,P<0.05];Hep-2细胞内的罗丹明较Hep-2/5-FU细胞明显升高[(89.83±0.52)%vs(14.38±0.48)%,P<0.01];Hep-2/5-FU细胞MDR1 mRNA[(13.69±1.12)vs(17.82±0.61),P<0.05]及其编码的MDR1-P蛋白水平高于Hep-2细胞。结论:Hep-2/5-FU细胞株具有明确及稳定的多药耐药性,为喉癌的耐药机制提供了研究的模型。

阶梯式诱导法建立抗5-FU细胞株MiaPaca2-5-FU

目的：建立稳定可传代的抗化疗药物5-FU或gemeitabine的MiaPaca2细胞株。方法：MiaPaca2细胞株暴露于浓度逐步升高的化疗药物5-FU或gemcitabine中(阶梯式诱导)，经过40周的筛选，XTT法测定吸光率，得出IC50值，算出诱导细胞株相对于母细胞株的耐药指数。结果：96孔培养板中，MiaPaca2细胞数约为1×10^4／孔，加入XTT后培养约2h后测XTT吸光率。根据药物浓度-细胞生存率曲线算出5-FU在亲代细胞株的IC50值为0．044±0．011mg／ml，在耐药株的IC50值为0．39±0．02mg／ml，算出MiaPaca2-5-FU的耐药指数RI>8倍；而MiaPaca2-gemeitabine的RI<8。亲代细胞株呈圆形，MiaPaca2-5-FU耐药株呈梭形。结论：通过阶梯式诱导法可以获得稳定的抗5-FU的MiaPaca2-5-FU细胞株。

小剂量顺铂联合5-氟尿嘧啶对胃癌细胞增殖抑制及其机制的研究

目的:探讨小剂量顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)在体外联合用药对SGC-7901胃癌细胞及胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-FU细胞增殖及其相关基因表达的影响。方法:采用MTT法观察在小剂量DDP、5-FU联合用药前后SGC-7901与SGC-7901/5-FU存活率的差异,同时应用免疫组化方法检测SGC-7901与SGC-7901/5-FU中p53、Fas/FasL基因的表达情况。结果:DDP与5-FU均有抑制肿瘤细胞增殖作用,且有浓度相关性;尤以DDP联合5-FU后对细胞存活率的影响明显高于两种药物的单独使用(P<0.01),小剂量DDP联合应用5-FU时效果最明显,但对SGC-7901/5-FU细胞增殖抑制作用明显小于SHC-7901;小剂量联合DDP+5-FU,p53、FasL基因表达的阳性率显著高于单纯的5-FU组或DDP组(P<0.01),而Fas基因表达则相反。结论:小剂量DDP联合5-FU对胃癌细胞具有明显抑制作用,对耐药株也有一定抑制作用,但效果弱于非耐药株。p53、Fas/FasL基因对胃癌细胞的增殖活性有重要作用,在小剂量DDP联合5-FU比各单药应用组基因的改变更明显(P<0.01)。

喉癌耐药细胞株Hep-2/5-Fu的建立及其差异表达基因的筛选

目的:建立喉癌细胞耐药模型Hep-2/5-Fu并初步筛选可能的耐药相关基因。方法:采用5-Fu大剂量浓度逐渐递增间歇给药的方法建立人喉癌耐药细胞Hep-2/5-Fu,观察其生长规律并绘制细胞生长曲线:用MTT法鉴定其耐药性并计算耐药指数(RI);用基因芯片技术检测耐药细胞株Hep-2/5-Fu与其亲本细胞株Hep-2中的差异表达基因,从中筛选出可能的耐药相关基因;用半定量RT-PCR法进行验证。结果:Hep-2/5-Fu细胞与Hep-2细胞相比,生长缓慢,细胞体积增大,并对顺铂及长春新碱有不同程度的交叉耐药性。通过基因芯片筛选出差异表达基因1210个,可能的耐药相关基因包括Cyclin D、IGF-BP3、CASP9、CDK4/6,其中Cyclin D在Hep-2/5-Fu中的表达是亲本细胞的6.599 7倍。结论:Hep-2/5-Fu细胞株耐药性稳定,耐药机制可能与Cyclin D等耐药相关基因有关。

JAK/STAT信号通路相关基因在人胃腺癌5氟尿嘧啶耐药细胞株中的表达变化

目的 用基因芯片技术研究人胃腺癌 5 氟尿嘧啶 (5 FU)耐药细胞株SGC7901 /R及其亲本细胞株SGC7901JAK/STAT信号传导通路相关基因表达谱的差异。方法 分别抽提两种细胞mRNA,经逆转录反应,用生物素标记的 16-dUTP将两种细胞的mRNA分别标记成两种cDNA探针,并与载有一组靶基因的人JAK/STAT信号通路芯片进行杂交,通过软件对扫描图像进行数字化处理和分析,筛选 2种细胞在该信号通路中有表达差异的基因。通过RT PCR法分别对耐药细胞及其亲本细胞中的Stat3、核因子(NF)-κB1和bcl-xmRNA的表达水平进行检测。结果 通过两种细胞株JAK/STAT信号通路的基因谱平行比较,筛选出人胃腺癌 5-FU耐药细胞株及其亲本细胞株中有表达差异 2倍以上的基因共 70个,其中表达上调>2倍的 40个,表达下调>2倍的 30个。RT-PCR的验证结果与芯片的筛查结果基本相符。结论 人胃腺癌 5- FU耐药细胞株中JAK/STAT信号通路基因表达谱的变化研究是对胃癌多药耐药分子机制研究的有力补充。

姜黄素对结肠癌氟尿嘧啶耐药细胞株中NKD2和TET1的调控作用

[目的]通过体外实验观察姜黄素对5-Fu耐药细胞株(5FUR)中NKD2、TET1及Caspase-3表达水平的影响。[方法 ]运用Western blot、Real-time q PCR检测不同浓度姜黄素对5FUR细胞及转染TET1 sh RNA后5FUR细胞内NKD2、Caspase-3蛋白和m RNA表达的影响。通过重亚硫酸测序(BSP)的方法,观察姜黄素对NKD2基因启动子去甲基化的干预情况。[结果]经过5-Fu培养而得到5FUR的IC50为(86.91±3.61)μg/ml(P<0.001)。HCT-116原代细胞5-Fu的IC50为(12.64±1.52)μg/ml,姜黄素对其增殖的抑制率为38.34%(P<0.001),姜黄素能显著上调5FUR细胞内NKD2、TET1的表达,且呈剂量依赖性。TET1转染敲低后检测发现5FUR细胞中的NKD2及Caspase-3的表达受到明显的抑制。[结论]姜黄素能从体外明显抑制结肠癌细胞5FUR的生长,其作用机制可能通过去甲基化调控蛋白TET1促使抑制基因NKD2基因启动子发生去甲基化,从而上调NKD2的表达,最终起到抑制肿瘤生长的作用。