下调Annexin A3基因对结肠癌HCT116/L-OHP细胞生物学特性影响

目的肿瘤患者体内人膜联蛋白A3(annexinA3,ANXA3)水平升高可能为结直肠癌(colorectal cancer,CRC)潜在筛查的标志物。本研究探讨ANXA3在CRC耐药细胞株HCT116/LOHP中表达,及其对细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法设计合成慢病毒载体GV493,感染HCT116/L-OHP耐药细胞株,实验分为对照组、空载体组、LV-ANXA3-RNAi-1实验组和LV-ANXA3-RNAi-2实验组4组。利用qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测ANXA3mRNA和蛋白表达水平;CCK-8法测定细胞体外增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Transwell双室法检测细胞侵袭能力。结果成功构建下调ANAX3稳定感染细胞株,与对照组(4.889±0.652 7)和空载体组(1.000±0.062 3)相比,实验组LV-ANXA3-RNAi-1(0.532 7±0.039 8)与LV-ANXA3-RNAi-2(0.466 9±0.014 8)的ANXA3mRNA表达量下降,F=125.5,P<0.001;实验组LV-ANXA3-RNAi-1、LV-ANXA3-RNAi-2的ANXA3蛋白表达为0.147 5±0.015 5、0.149 1±0.010 7与对照组(0.937 4±0.025 8)和空载体组(0.678 5±0.063 7)相比,ANXA3蛋白表达量下降,F=123.2,P<0.001;实验组细胞增殖速度减慢,P<0.001;LV-ANXA3-RNAi-1和LV-ANXA3-RNAi-2实验组细胞凋亡率分别为(26.2±0.519 6)%、(36.47±0.545 7)%,高于对照组(7.2±0.404 1)%和空载体组(3.3±0.230 9)%,F=1 259,P<0.001;LV-ANXA3-RNAi-1和LV-ANXA3-RNAi-2实验组穿透滤膜的细胞数量分别为63.67±6.119、50.00±5.132,少于对照组(112.3±1.453)和空载体组(100.0±4.359)穿透滤膜的细胞数量,细胞侵袭能力下降,F=40.89,P<0.001。结论下调ANXA3基因可抑制人结肠癌细胞HCT116/L-OHP的增殖,促进细胞凋亡,降低细胞的侵袭能力。

人参皂苷Rh_2对结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP侵袭迁移能力的影响

目的:观察人参皂苷Rh_2(ginsenoside Rh_2,GRh_2)对结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP迁移、侵袭的影响,并探讨其作用机制。方法:细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测不同质量浓度GRh_2(0,2. 5,5,10,20,40 mg·L^(-1))对HCT116/L-OHP细胞增殖抑制作用;划痕实验,Transwell实验及黏附实验分别检测GRh_2(0,2. 5,5,10 mg·L^(-1))对细胞迁移、侵袭及黏附能力的影响;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GRh_2(0,5,10,20,30 mg·L^(-1))对HCT116/L-OHP细胞上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达水平的影响。结果:与空白组比较,GRh_2(5,10,20,40 mg·L^(-1))可显著抑制HCT116/L-OHP耐药细胞的增殖能力(P <0. 05,P <0. 01),并且呈浓度依赖性;与空白组比较,GRh_2组(5,10 mg·L^(-1))划痕愈合率明显减小(P <0. 05,P <0. 01),GRh_2组穿过小室的细胞数量明显减少(P <0. 05,P <0. 01),细胞的迁移和侵袭能力受到显著抑制,并且呈浓度依赖性; GRh_2组黏附细胞数量显著减少(P <0. 05,P <0. 01),细胞的黏附能力受到显著抑制,并且呈浓度依赖性;与空白组比较,GRh_2(10,20,30 mg·L^(-1))促进了E-cadherin的蛋白表达(P <0. 05,P <0. 01),同时抑制了MMP-9蛋白表达(P <0. 01),呈一定的浓度依赖性。结论:GRh_2可显著抑制结肠癌耐药细胞HCT116/L-OHP的侵袭和迁移能力,其潜在机制可能与促进E-cadherin并抑制MMP-9的表达有关。

尼卡地平对结肠癌细胞HCT116/L耐药的逆转作用研究

目的探究尼卡地平逆转耐奥沙利铂结肠癌细胞HCT116/L耐药的疗效及其机制。方法采用MTT法分别检测尼卡地平和奥沙利铂在HCT116/L和HCT116细胞上的药敏性,并检测尼卡地平能否逆转奥沙利铂耐药。采用流式细胞仪(FCM)检测HCT116/L细胞凋亡和细胞内罗丹明-123的浓度。结果奥沙利铂在耐药细胞HCT116/L及亲本细胞HCT116的IC50分别为(20.07±1.32)μM,(0.65±0.05)μM,具有明显的耐药差异性(P<0.001),耐药指数(RI)为(30.86±2.21)。尼卡地平在耐药细胞HCT116/L及亲本细胞HCT116的IC50分别为(22.76±1.52)μM,(21.65±1.35)μM,两者之间的细胞毒性没有统计学差异。FCM法检测结果显示尼卡地平和奥沙利铂联用能显著增加耐药细胞株凋亡率(P<0.001),且能明显增加耐药细胞HCT116/L内罗丹明-123的浓度。结论尼卡地平能增强HCT116/L细胞对奥沙利铂的敏感性,其逆转耐药的作用与诱导耐药细胞HCT116/L凋亡,影响转运蛋白P-gp的功能有关。

奥沙利铂与7-羟基星形孢菌素对结肠癌HCT116细胞的杀伤作用及其机制的研究

目的奥沙利铂与7-羟基星形孢菌素单独及联合应用，探讨诱导结肠癌细胞HCTl16死亡的作用机制。方法应用MTT法检测L-OHP、UCN-01单药及联用对HCTll6细胞的增殖抑制作用；应用流式细胞术、Western blot方法检测药物处理后的结肠癌细胞凋亡情况；应用HE染色法检测丝裂灾变的形态改变。结果低浓度L-OHP（6．25pμmol／L）与UCN-01（100nmol／L）联用对结肠癌HCTll6细胞的杀伤可产生协同作用，效果明显强于单独用药组；两药联用AnnexinV阳性细胞率与UCN-01单用无明显差别，但死亡细胞明显增加；两药联用HCTll6细胞的形态发生改变，巨核多核细胞较单独用药组增多约10％。结论 L-OHP与UCN-01联用对HCTll6细胞具有协同抑制作用，诱导HCTll6细胞发生凋亡和丝裂灾变。

奥沙利铂和7-羟基星形孢菌素联合用药对HCT116细胞的抑杀作用

目的:观察奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)与7-羟基星形孢菌素(7-hydroxystaurosporine,UCN-01)单独及联合应用对结肠癌细胞HCT116的增殖抑制作用,探讨其诱导细胞死亡的作用机制。方法:应用MTT法检测L-OHP,UCN-01单药及联用对HCT116细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞术、Western blot方法检测药物处理的结肠癌细胞凋亡;应用HE染色法检测丝裂灾变的形态改变。结果:低浓度L-OHP(6.25μmol·L-1)与UCN-01(100 nmol·L-1)联用对结肠癌HCT116细胞的杀伤可产生协同作用,效果明显强于单独用药组;两药联用Annexin V阳性细胞率与UCN-01单用无明显差别,但死亡细胞明显增加;两药联用HCT116细胞的形态发生改变,巨核多核细胞较单独用药组增多约10%。结论:L-OHP与UCN-01联用对HCT116细胞的增殖具有协同抑制作用,诱导细胞发生凋亡和丝裂灾变。

5-氮杂-2:脱氧胞苷调控ERCC1和hMLH1表达逆转结肠癌细胞奥沙利铂耐药的机制

目的通过构建结肠癌耐奥沙利铂细胞株(HCT116/L-OHP),探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)逆转奥沙利铂耐药的可能机制及其与切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、人类错配修复基因1(hMLH1)的关系。方法采用奥沙利铂浓度梯度递增法,建立耐奥沙利铂的细胞株HCT116/L-OHP,CCK法筛选出奥沙利铂、5-Aza-CdR对各组细胞的半数抑制浓度(IC50),流式细胞仪检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹法分别检测使用5-Aza-CdR处理细胞前后ERCC1、hMLH1基因和蛋白表达水平。结果成功构建了稳定耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP,选取5μmol/L 5-Aza-CdR和100 mg/L奥沙利铂行体外敏感性实验,随着时间延长,各组对HCT116/L-OHP细胞株增殖抑制率呈上升趋势,5-Aza-CdR联合奥沙利铂组增殖抑制率较高,药物和时间的作用效应存在交互作用,F分组=89.743,P<0.001;F时间=28.249,P<0.001;F分组×时间=42,785,P<0.001。经5-Aza-CdR联合奥沙利铂处理HCT116/L-OHP 24 h后细胞凋亡结果显示,联合用药组相对于奥沙利铂单药组的细胞凋亡率由(17.94±1.58)%上升至(34.88±2.15)%,两药存在协同性的交互作用,F=48.232,P<0.001。RT-PCR结果显示,HCT116对照组、HCT116/L-OHP组和5-Aza-CdR处理组ERCC1基因水平分别为1.54±0.08、1.85±0.07和1.72±0.06,F=254.126,P<0.001;hMLH1水平分别为1.14±0.07、0.81±0.05和1.02±0.06,F=156.827,P<0.001。蛋白质印迹结果显示,HCT116对照组、HCT116/L-OHP组和5-Aza-CdR处理组ERCC1水平分别为0.29±0.03、0.80±0.05和0.54±0.02,F=251.274,P<0.001;hMLH1水平分别为0.56±0.08、0.46±0.05和0.76±0.09,F=153.683,P<0.001。结论 5-Aza-CdR可明显抑制奥沙利铂作用下人结肠癌耐药细胞株HCT116/L-OHP的增殖作用,诱导凋亡,其作用可能与影响ERCC1和hMLH1表达有关。

竹节香附素A对耐奥沙利铂肠癌细胞株的作用及机制研究

目的探讨竹节香附素A(RA)对人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT116/L-OHP的逆转作用及其可能机制。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、耐多药基因1(MDR1)等基因的表达;免疫荧光试验及蛋白免疫印迹(WB)检测Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、P-gp、IκB-α、P65蛋白的表达情况。结果RA可增加HCT116/L-OHP细胞株对奥沙利铂的敏感性,两药联合后的半数抑制浓度(IC50)从原来的(234.12±6.13)μg/mL降低至(140.45±2.25)μg/mL,耐药逆转倍数约为1.67,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术显示,单用奥沙利铂时,细胞凋亡率为20.5%,而联合RA后,细胞凋亡率增加至34.4%,差异有统计学意义(P<0.01);RT-PCR及WB结果显示,凋亡关键因子caspase-3、PARP在联合组中表达较单用奥沙利铂组增加;耐药蛋白基因MDR-1及其编码蛋白P-gp在联合组中的表达较单药奥沙利铂组减少;此外,WB结果还显示,核因子-κB(NF-κB)信号通路中IκB-α、P65在联合组中的表达较单药组减少。结论RA可增加结肠癌耐奥沙利铂细胞株对奥沙利铂的敏感性可能与调节NF-κB信号通路减少P-gp的表达有关。

南葶苈子与白芥子寒热药性的细胞学方法评价

目的:用细胞学方法评价南葶苈子与白芥子的寒热药性。方法:用噻唑蓝(MTT)比色法考察南葶苈子与白芥子对HepG2细胞、SMMC7721细胞、HCT116细胞体外增殖的影响,倒置显微镜观察南葶苈子与白芥子对细胞形态的影响,台盼蓝染色法分析南葶苈子与白芥子的细胞毒作用。结果:南葶苈子在2~800μg/mL浓度范围内对3种细胞的生长增殖表现出抑制作用,随着浓度的增大,抑制率增大,判定为寒性;白芥子在2~800μg/mL浓度范围内对3种细胞的生长增殖表现出低浓度促进、高浓度抑制作用,判定为热性。南葶苈子能使细胞密度减小,固缩变圆;白芥子低浓度下使细胞密度增加,细胞结构致密,生长旺盛,高浓度下使细胞密度降低,固缩变圆。南葶苈子与白芥子对于这3种细胞没有细胞毒作用。结论:南葶苈子和白芥子寒热药性细胞学方法评价结果与文献记载一致;细胞学方法可用于南葶苈子与白芥子寒热药性研究。