丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4的克隆化研究

目的 探索丙型肝炎病毒 (HCV)核心 (core)蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,以有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 应用表达谱芯片分析等分子生物学技术 ,结合生物信息学 (bioinformatics)技术 ,筛选、克隆HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 core ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 core转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆核心蛋白反式激活的新型靶基因 ,命名为HCTP4,新基因的编码基因序列全长为 2 2 44个核苷酸 (nt) ,编码产物由 748个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV核心蛋白是具有反式激活作用的蛋白。DNA微矩阵技术 (DNAmicroarray)是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因 。

应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α), 提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α- 半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链:6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11- 507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11- 75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509119克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G: 1个UMP-CMP激酶;1个新基因. 结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.

基因表达谱芯片技术筛选HCTP4反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的反式调节基因HCTP4作用的靶基因. 方法:构建HCTP4基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)- HCTP4,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)- HCTP4转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞差异表达的mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染HCTP4后,有104条差异基因表达,其中54条基因表达增强,50条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关. 结论:HCTP4是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响,与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关,在HCV的致病过程中有重要作用.

HCTP方案治疗成人急性非淋巴细胞白血病疗效及预后因素的探讨——107例分析

临床已证实,有三尖杉酯硷在内的联合化疗方案HOAP或HOP治疗急性非淋巴细胞白血病(ANLL),获得较好效果.为探讨三尖杉酯硷、环胞苷(或阿糖胞苷)、6-硫鸟嘌呤和强的松组成的HCTP或HATP方案的疗效及预后因素,我们将1984年2月至1988年9月用HCTP或HATP方案治疗的ANLL患者107例进行总结、分析,现报告如下。资料与方法 1.一般资料本组均为入院前未曾治疗过的病人,共107例.男71例,女36例,年龄14～76岁.

pET15b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体的构建、表达及其意义

目的：HCTP（HPV tansformed cervical cancer cell targeting penetratin HCTP）是新近发现的一种能特异性识别并穿透HPV转化宫颈癌细胞胞膜的短肽。构建HCTP与绿色荧光蛋白（GFP）、凋亡素（Apoptin）的重组表达载体，原核系统表达并纯化出GFP-HCTP、Apoptin-HCTP融合蛋白，研究HCTP的特异性靶向穿膜效应。方法：根据美国NIH基因库收藏的Apoptin基因序列，利用多重PCR技术拼接出Apoptin cDNA、运用PCR方法以pEGFP-C1质粒为模版扩增获得GFP cDNA片段，将Apoptin及GFP cDNA分别与退火形成的HCTP双链连接并克隆至原核表达载体pETl5b，成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP重组表达载体。DNA测序证实重组构建无误，用上述两个重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）．以IPTG诱导融合蛋白表达并用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化试剂纯化，获得可溶性基因重组融合蛋白GFP-HCTP和Apoptin-HCTP。运用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定目的蛋白。结果：成功构建pETl5b-GFP-HCTP、pETl5b-Apoptin-HCTP原核表达载体，经表达、纯化制备了GFP-HCTP和Apoptin-HCTP基因重组融合蛋白。结论：我们使用基因工程技术，经原核表达系统表达制备的GFP-HCTP和Apoptin-HCTP融合蛋白将为进一步研究HCTP的特异穿膜效应以及探讨HCTP作为宫颈癌治疗药物的靶向运送载体提供实验基础。

两种不同品种的南瓜多糖降糖效果研究

不同品种南瓜多糖的含量及种类差异较大,南瓜果肉根据其糖含量可归纳为高糖型南瓜和低糖型南瓜两大类,为探寻不同品种的南瓜对糖尿病小鼠血糖的影响,本实验选用南方市场上常见的两种不同类型的南瓜,采用新的分离工艺从南瓜粉中提取得到南瓜多糖,对其营养组成及降血糖效果进行了研究。结果表明,高糖型南瓜的干物质及总糖含量较高,降血糖效果不明显;低糖型南瓜的干物质和总糖含量较低,降血糖效果显著。

一种安全的单点登录系统口令同步方案

针对现有单点登录(SSO)系统难以有效支持口令同步的问题,设计一个安全性和扩展性更好的SSO系统模型,利用最优非对称加密填充算法修改明文,采用RSA加密算法产生数字证书,在此基础上改进混合密码传输协议,以更好地实现SSO系统中服务器、客户端代理服务器及认证机构三者之间的传输应用。通过对口令同步的实现,验证该方案相比原协议即时性更强、口令密钥安全性更高,能有效抵抗选择密文攻击。

一种用于口令同步的通用混合密码传输协议

结合基于对称密钥的认证协议和基于公开密钥的认证协议,提出了一种用于口令同步的通用混合密码传输协议,给出了具体的需求分析、算法选择和协议内容,并在协议分析的基础上用BAN逻辑证明了它的有效性.分析结果证明,该协议能够达到预期目标.

HLFO方案治疗晚期胃肠癌

目的：观察羟基喜树碱（HCPT）持续给药联合奥沙利铂、甲酰四氢叶酸／氟尿嘧啶组成的HLFO方案治疗晚期胃肠癌的近期疗效、毒性反应及生存期。方法：21例患者，均为经病理组织学确诊并有远处转移的晚期胃肠癌患者，其中原发病为胃癌9例，大肠癌12例。合并肺转移5例，肝转移12例，骨转移3例，腹壁转移4例。采用含羟基喜树碱（HCPT）5mg civ 24h d1～d5；奥沙利铂（OXA）85mg／m^2，ivgtt 2h，d1；甲酰四氢叶酸（CF）200mg／m^2 ivgtt 2h，d1，d2；氟尿嘧啶（5-FU）400mg／m^2，iv，d1，d2；氟尿嘧啶600mg／m^2，civ 24h，d1，d2，每2周重复。按照WHO标准评价疗效和毒性。结果：全组21例均可评价，获得CR2例，PR8例，SD7例，PD4例，总有效率47．6％，中位生存期（MST）9个月。主要毒性反应为感觉神经毒性、骨髓抑制和胃肠道反应，均较轻微。结论：HLFO方案治疗晚期胃肠癌近期疗效好，不良反应轻，耐受性良好，值得进一步研究。

膀胱癌保留膀胱术后膀胱灌注药物的疗效观察

目的探讨吡柔比星(pirarubicin,THP)、羟基喜树碱(hydroxycamptothecin,HCPT)、丝裂霉素(mitomycin,MMC)三种不同药物膀胱灌注化疗对预防膀胱癌保留膀胱术后复发的安全性评估。方法将162例晋东地区膀胱癌保留膀胱术后膀胱灌注的膀胱癌患者随机分为三组,Ⅰ组采用THP方案(76例),Ⅱ组采用HCTP方案(62例),Ⅲ组采用MMC方案(24例)。分别于术后1～2周开始规律膀胱灌注。比较三组复发率。结果所有患者均随访2年以上。Ⅰ组复发率为13.5%,Ⅱ组复发率14.8%,Ⅲ组复发率19.6%。Ⅰ、Ⅱ组与Ⅲ组比较差异有显著性(P<0.05)。结论THP、HCTP膀胱灌注对膀胱癌保留膀胱术后防止复发疗效满意,副作用轻,耐受性好且安全。