丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4的克隆化研究

目的 探索丙型肝炎病毒 (HCV)核心 (core)蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,以有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 应用表达谱芯片分析等分子生物学技术 ,结合生物信息学 (bioinformatics)技术 ,筛选、克隆HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 core ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 core转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆核心蛋白反式激活的新型靶基因 ,命名为HCTP4,新基因的编码基因序列全长为 2 2 44个核苷酸 (nt) ,编码产物由 748个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCV核心蛋白是具有反式激活作用的蛋白。DNA微矩阵技术 (DNAmicroarray)是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCV核心蛋白反式激活作用的新的靶基因 。

应用白细胞cDNA文库的酵母双杂交技术筛选HCTP4结合蛋白基因

目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HCTP4蛋白结合的蛋白的编码基因. 方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCTP4基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α), 提出质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HCTP4基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α- 半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落44个,其中25个免疫球蛋白λ轻链:6个来自RP11-189K21克隆的人DNA序列;4个来自RP11- 507C10克隆的人DNA序列;2个人BAC克隆RPCI11- 75L1;1个人BAC克隆RP11-21M10;1个人遍素酶智能弹(MIB);1个来自RP11-867O8克隆的人DNA基因;1个来自RP3-509119克隆的人DNA序列;1个小核糖核蛋白G: 1个UMP-CMP激酶;1个新基因. 结论:成功克隆出HCTP4的结合蛋白,为进一步研究丙型肝炎病毒(HCV)的作用提供了新线索.

基因表达谱芯片技术筛选HCTP4反式调节基因

目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒核心(HCV core)蛋白的反式调节基因HCTP4作用的靶基因. 方法:构建HCTP4基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)- HCTP4,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)- HCTP4转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞差异表达的mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染HCTP4后,有104条差异基因表达,其中54条基因表达增强,50条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关. 结论:HCTP4是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响,与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关,在HCV的致病过程中有重要作用.