丙型肝炎病毒HCV E1区基因在真核细胞中的表达及表达产物的初步应用

目的:建立丙型肝炎病毒包膜区基因的真核表达载体,并对表达产物进行鉴定,同时测定表达产物与抗HCV阳性血清的反应情况。方法:用限制性内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ从原核表达载体pMSCVE1中切下HCVE1区的基因片段,并将其克隆到真核表达载体PcDNA3.1中,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后,用磷酸钙共沉淀法将其转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中,同时利用WesternBlot方法对表达产物进行鉴定;测定表达产物与20份抗HCV阳性血清标本和10份抗HCV阴性的血清标本的反应性。结果:经酶切过夜后从原核表达载体上切下的基因片段与经过同样双酶切的真核表达载体PcDNA3.1连接,阳性克隆经SmaⅠ和XbaⅠ酶切后产生了预期大小的354bp的片段。经磷酸钙转染,产生了具有对G418抗性的细胞克隆,经WesternBlot方法用抗HCVE1区合成肽抗原的单抗检测表达产物,产生了特异的反应;并证实该表达产物与HCV患者的血清有特异反应。经WesternBlot证实在抗HCV阳性血清中有35%(7/20)可与表达产物产生特异的反应;阳性细胞经3个月传代后,仍可检测到HCVE1的表达产物。结论:此项研究所建立的能够表达HCVE1基因细胞系表达产物可与阳性血清发生特异性反应,该细胞系的建立为进一步研究抗HCVE1抗体的临床意义及进行有关HCV核酸免疫的研究创造了条件。

丙型肝炎病毒E1基因的克隆、表达、序列分析及定点突变

目的 :为了获得具有完整框架的HCVE1基因。方法 :用RT PCR从HCV(+)血清中扩增出E1基因 ,在原核系统中进行表达、测序及定点突变 ,并对表达的E1蛋白进行纯化及初步的活性鉴定。结果 :在 86株阳性克隆中 ,11株表达了不完整的HCVE1蛋白 ;使用表达出来分子量最大的蛋白作为抗原 ,在HCV(+)血清中抗 E1的检出率为 16 .7% (2 / 12 ) ,对其插入的E1基因 (HCVe118)测序 ,表明 134 7位的C→T而形成终止密码 ,用“大引物”法对HCVe118作定点突变 ,使T→C ,从而获得具正确框架的HCVE1基因。结论 :在原核表达系统中 ,去除C末端的HCVE1基因可获得高效表达 ;表达的HCVE1蛋白抗原性很弱。“大引物”法用于基因改构工作简便而又快速。

丙型肝炎病毒E1基因在COS-7中的表达

目的 :了解丙型肝炎病毒 (HCV)E1基因在真核细胞中的表达情况。方法 :采用基因重组技术 ,构建含HCVE1基因的重组表达质粒pEF1/HisC E1,经酶切和PCR鉴定后 ,用脂质体转染法将重组质粒导入COS 7进行表达 ,经蛋白印迹实验鉴定表达产物。结果 :重组表达载体pEF1/HisC E1在COS 7中获得表达。表达的E1糖蛋白约 2 9kD ,具有抗原性。结论 :HCVE1基因在真核细胞高效表达 。

丙型肝炎病毒C+E1区基因在原核细胞中的克隆与表达

将丙型肝炎病毒Ｃ＋Ｅ１区基因插入到原核高效表达载体ｐＢＶ２２１质粒中，构建了质粒ｐＢＶ２２１ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１作为表达载体，然后，将含有该质粒的宿主大肠杆菌进行升温诱导表达ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１区基因，并对表达产物进行了生物活性的检测。结果表明，插入到表达载体ｐＢＶ２２１中的ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１基因片段能够得到有效的表达，表达产物主要为非融合蛋白形式存在于细胞中。